[發明專利]雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因和大腸桿菌基因的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201310285642.6
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103436602A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 龔頻;王蘭;張濤濤;陳福欣
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測技術領域，涉及一種雙重分子信標-環介導等溫擴增技術同時檢測兩種食源性致病菌的方法，具體涉及雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒及方法。?

背景技術

民以食為天，食以安為先。食品安全問題已經成為困擾全世界的一個重大的安全隱患問題，特別是病原微生物所致的食品污染及食源性疾病已成為一個世界性公共衛生問題。世界衛生組織(WHO)報告稱全世界每年發生的食源性疾病數十億例，發達國家每年至少有三分之一的人群患食源性疾病，其中約有170萬15歲以下兒童因食源性微生物污染引起腹瀉而死亡。微生物性食物中毒事件中常見的重要致病菌為：金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌、肉毒梭菌、李斯特單核細胞增生菌、假單細胞菌和大腸桿菌O157：H7等。?

目前我國食品衛生監督檢驗部門對食源性疾病的病原檢測、鑒定手段仍停留在傳統的病原菌培養、血清抗體檢測和生化特征比較水平，檢測時間一般為2-4天之間，有些甚至達到7天，而且生化實驗和血清學實驗不穩定，檢測靈敏度較低，另外，當前的檢測手段一般只能檢測一種病原微生物，而大部分情況下，食品的污染都不是單菌感染，從而增加了鑒定的工作量，減低了檢測效率。?

隨著分子生物學技術的發展，人們采用PCR技術應用于細菌的診斷。例如中國專利公開號為CN1526825的專利申請中提到一種通過DNA提取、PCR擴增、電泳及凝膠成像觀察等手段檢測副溶血弧菌的?方法。然而PCR技術容易受到污染，此外其需要特殊的儀器和設備，對操作人員的技術要求高，因而限制了其廣泛的應用。?

環介導等溫擴增（LAMP）技術是2000年日本Notomi?T等人開發出來的一種新的核酸擴增方法，可以把渾濁度作為鑒定指標，只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察等過程，易于在一些基層機構推廣和應用，有著極為廣泛的應用前景。LAMP技術被廣泛的應用于檢測食品中EcoliO157：H7、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、副溶血性弧菌、糞腸球菌、志賀氏菌、假結核耶爾森氏菌、遲鈍華氏菌(E．tarda)、沙門氏菌等許多細菌的檢測，結果均顯示出了該方法的高特異、高靈敏度。但是，LAMP產物易受氣溶膠污染，造成假陽性結果。?

分子信標技術是1996年Tyagi和Kramer首先提出的一種基于核酸堿基配對原則和熒光共振能量原理設計的具有頸環構型的分子探針，在PCR擴增的退火階段，分子信標與生成的靶序列結合發出熒光，在延伸階段，脫離靶序列而不干擾擴增，隨著循環次數的增加，與模板結合的分子信標的量亦增加，最終的熒光強度與擴增的模板量成正比。該技術具有極高的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別是它可以進行實時定量檢測、甚至可以用于活體分析。?

由于生態環境的變化和抗生素的濫用，很多致病菌所引起的臨床癥狀越來越不典型，常常需要同時檢測多種細菌才能確定致病原，因此，亟需建立一種能夠快速、高特異性和靈敏性、同時檢測多種病原微生物的診斷技術。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒及方法，?能夠快速、有效的檢測出金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因兩種食源性致病菌。?

雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒，包括LAMP反應體系，所述LAMP反應體系中含有檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157：H7的rfbE基因的引物組，該引物組包含nuc基因的一對外引物F3、B3，一對內引物FIP、BIP和一個分子信標探針；還包含rfbE基因的一對外引物F3、B3，一對內引物FIP、BIP和一個分子信標探針；?

其中，所述的nuc基因的引物組為：?

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；?

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；?

內引物FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；?

內引物BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；?

分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；?

所述的rfbE基因的引物組為：?

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；?

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；?