[發明專利]雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因和大腸桿菌基因的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201310285642.6
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103436602A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 龔頻;王蘭;張濤濤;陳福欣
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒，其特征在于，包括LAMP反應體系，所述LAMP反應體系中含有檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157：H7的rfbE基因的引物組，該引物組包含nuc基因的一對外引物F3、B3，一對內引物FIP、BIP和一個分子信標探針；還包含rfbE基因的一對外引物F3、B3，一對內引物FIP、BIP和一個分子信標探針；

其中，所述的nuc基因的引物組為：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

內引物FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

內引物BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；

所述的rfbE基因的引物組為：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；

內引物FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；

內引物BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；

分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；

所述的LAMP反應體系的總體積為25μl，包括以下組分：

1）2μl的待測樣品模板DNA；

2）nuc基因和rfbE基因的外引物F3、B3各0.4μM/L，內引物FIP、BIP各2.4μM/L，rfbE基因的外引物F3、B3各0.4μM/L，內引物FIP、BIP各2.4μM/L；

3）DNA聚合酶：每μl含8個活性單位的Bst?DNA聚合酶；

4）2.8mmol/l的dNTP，0.8mol/l的甜菜堿，2μl的Buffer，2μl的ddH₂O。

2.根據權利要求1所述的雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒，其特征在于，所述的Nuc基因的分子信標探針的核苷酸序列的5’端連接有熒光染料Rox，3’端連接有熒光猝滅基團DABCYL。

3.根據權利要求1所述的雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒，其特征在于，所述的rfbE基因的分子信標探針的核苷酸序列的5’端連接有熒光染料FAM，3’端連接有熒光猝滅基團DABCYL。

4.采用權利要求1所述的雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的試劑盒進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）采用LAMP反應體系，該體反應體系包括金黃色葡萄球菌基因nuc的引物和分子信標探針，大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的引物和分子信標探針；

2）待測樣品處理及模板提取

取待測細菌樣品，用生理鹽水懸浮后，離心，取沉淀，向沉淀中加入樣品預處理液，混合均勻后，煮沸10min后，冷卻10min，再次離心，取上清，得到待測樣品的模板DNA；

3）LAMP等溫擴增

將待測樣品的模板DNA加入到LAMP反應體系中，在60～70℃下，反應50～70min；

4）顯色檢測

取LAMP等溫擴增后的產物，加入顯色液，與陽性對照，直接以肉眼觀察變化。

5.根據權利要求4所述的雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的檢測方法，其特征在于：步驟2）所述的樣品預處理液是將40μl20mg/mL的溶菌酶，30μl10%的SDS，10μl20mg/mL的蛋白酶K和100μl5mol/L的NaCl，充分混勻后，在8000r/min下，離心10min后，得到的上清液。

6.根據權利要求5所述的雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的檢測方法，其特征在于：所述的溶菌酶在使用前先在37℃下，保溫30min；所述的蛋白酶K在使用前先在53℃下，保溫30min。

7.根據權利要求4所述的雙重分子信標-LAMP法同時檢測金黃色葡萄球菌基因nuc和大腸桿菌O157:H7的rfbE基因的檢測方法，其特征在于：步驟2）所述的離心是在8000～12000r/min下，離心1～3min。