[發明專利]一種重組大腸桿菌及制備磷脂酶C的方法和大豆毛油脫膠方法

無效

• 申請號: 201310285505.2
• 申請日: 2013-07-07
• 公開（公告）號: CN103525745A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 常明;芮麗蓮;劉睿杰;金青哲;王興國;劉元法
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/16;C12N15/55;C11B3/00;C11B3/04;C12R1/19
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一種重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a-Sa-PLC，保藏編號為CCTCC?No.M2013300。

2.根據權利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于：由下述方法制得：

（1）以保藏編號為GIM1.142(ATCC6538)的金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，克隆得到磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示；

（2）將(1)所得的磷脂酶C基因克隆到pET-28a(+)表達載體上，構建得到重組的表達質粒；

（3）將(2)所得的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a-Sa-PLC。

3.用權利要求1或2所述重組大腸桿菌制備磷脂酶C的方法，其特征在于：以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備磷脂酶C。

4.根據權利要求3所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：具體步驟如下：

（1）將重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a-Sa-PLC接種于含硫酸卡那霉素50mg/mL的種子培養基中，于37℃，180～200r/min搖瓶培養至對數生長期，作為種子液；

（2）將(1)中所述種子液按1%～5%的接種量接種到發酵培養基中，于37℃，180～200r/min搖瓶培養至OD₆₀₀=0～1.2，再添加IPTG至終濃度0.001～0.1mM，于18～37℃，180～200r/min條件下誘導培養3～30h；

（3）將(2)中所得發酵液離心，收集菌體沉淀，用緩沖液重懸并超聲破碎細胞，將細胞破碎液離心，取上清，即為制備得到的磷脂酶C粗酶液。

5.根據權利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：步驟(1)所述種子培養基成分為：NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4。

6.根據權利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于：步驟(2)所述發酵培養基成分為：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油0.4%(v/v)，KH₂PO₄0～170mM，K₂HPO₄0～720mM。

7.根據權利要求4所述磷脂酶C制備方法，其特征在于：所述步驟(3)重懸緩沖液為50mM?pH7.2的Tris-HCl，其中MgCl₂的濃度為0～10mM。

8.一種大豆毛油脫膠方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）將大豆毛油加熱至60～95℃，加入質量濃度35%～55%的檸檬酸，檸檬酸體積與毛油質量的關系為1.2mL/kg，300r/min攪拌速度下酸處理20min；

（2）將(1)中處理完的大豆毛油冷卻至40～60℃，加入質量濃度為4%的NaOH溶液調節體系pH在4～6之間；

（3）按400～2000U/kg大豆毛油的比例加入如權利要求3方法所制備的磷脂酶C，再加入蒸餾水，磷脂酶C酶液和蒸餾水的總體積占油重的2%～5%，混合均勻；

（4）在300r/min攪拌速度下，進行酶法脫膠，反應時間為0.5～4h；

（5）將脫膠體系煮沸10min滅酶，于10000r/min轉速下，離心10min，保留上層油樣，完成脫膠。