[發(fā)明專(zhuān)利]一種重組大腸桿菌及制備磷脂酶C的方法和大豆毛油脫膠方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310285505.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103525745A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 常明;芮麗蓮;劉睿杰;金青哲;王興國(guó);劉元法
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N9/16;C12N15/55;C11B3/00;C11B3/04;C12R1/19
• 代理公司: 無(wú)錫互維知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛(ài)偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和油脂脫膠領(lǐng)域，特別涉及一株重組大腸桿菌制備磷脂酶C的方法及該酶催化大豆毛油脫膠方法。?

背景技術(shù)

磷脂酶C（phospholipase?C,PLC）可以催化水解磷脂Sn-3位酯鍵產(chǎn)生甘油二酯(DAG)和磷酸化的頭部基團(tuán)。根據(jù)PLC的底物特異性，主要可以將細(xì)菌來(lái)源的PLC分為2大類(lèi)：磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)和磷脂酰膽堿偏好型磷脂酶C(PC-PLC)。PLC的水解產(chǎn)物三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DAG）在信息傳遞和細(xì)胞代謝中起著重要作用，前者能促使Ca²⁺從鈣庫(kù)中釋放出來(lái)；DAG能激活蛋白激酶K(PKC)，從而觸發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)功能，如：細(xì)胞增殖，信號(hào)空間分布等。PLC在對(duì)抗心腦血管疾病，抗血小板聚集和抗腫瘤等方面具有潛在價(jià)值。隨著PLC研究的深入，其應(yīng)用范圍也在不斷拓寬，從醫(yī)藥領(lǐng)域擴(kuò)展到化工和食品加工等領(lǐng)域，例如：PLC處理神經(jīng)鞘磷脂生成的神經(jīng)酰胺被廣泛用作化妝品的保濕成分；PLC能夠改善冷凍保存的生面團(tuán)在烤制時(shí)產(chǎn)生的表面老化現(xiàn)象、緩和梨皮裝表皮；PLC還可以用來(lái)做酶法脫膠，進(jìn)一步提高油脂精煉的效率等。?

產(chǎn)PLC的細(xì)菌很多，例如：蠟樣芽孢桿菌(Bacillus?cereus)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis),產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium?perfringens)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus?aureus)，單增李斯特氏菌(Listeria?monocytogenes)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)等等。早在上世紀(jì)80年代國(guó)外就有利用基因工程菌表達(dá)PLC的報(bào)道：1982年，Vasil等人構(gòu)建了一株P(guān).aeruginosa?PAO2003(pVB81)-CT，該菌株所產(chǎn)PLC的酶活達(dá)到442.8U/ml；1997年Cota-Gomez等人構(gòu)建了E.coli?BL21(DE3)pGEM-PLCHR，該菌株所產(chǎn)PLC酶活可達(dá)24.1U/mg。國(guó)內(nèi)對(duì)PLC研究起步較晚，例如：2003年，王常高等篩選出15株磷脂酶高產(chǎn)菌株；并對(duì)其中四株菌進(jìn)行了分類(lèi)鑒定；2005年，陳濤等在此基礎(chǔ)上，對(duì)高產(chǎn)磷脂酶菌株B.cereus?ShenZhen754-1進(jìn)行了紫外線(xiàn)和⁶⁰Co-γ射線(xiàn)誘變處理，獲得了3株高產(chǎn)突變株，磷脂酶活性分別達(dá)到14.878、16.450、16.400U/ml。2013年，趙金星等成功篩選到一株銅綠假單胞菌，并構(gòu)建產(chǎn)PLC的重組大腸桿菌，酶活可以?達(dá)到722.89U/ml。?

脫膠是大豆油精煉過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到精煉油品質(zhì)的好壞。大豆油中的膠質(zhì)主要是磷脂，磷脂含量高會(huì)影響油的儲(chǔ)藏、精煉和加工故需將大豆油的磷含量降低至10ppm以下，才能滿(mǎn)足油脂精煉的要求。酶法脫膠反應(yīng)條件溫和，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，而且減小了中性油的損失，PLC脫膠只需少量水分，并可以除去非水化磷脂，能大大減少?gòu)U水的排放量。孟慶飛等人進(jìn)行了PLC水解大豆油磷脂的研究，使毛油的精煉率提高了3.08%。Purifine公司已有用于油脂工業(yè)脫膠和精煉的PLC產(chǎn)品，大豆毛油中磷脂的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1.76%，Purifine?PLC能水解其中的70%，生成的DAG80%能留在最終產(chǎn)物中，相當(dāng)于增加了0.99%的產(chǎn)量。?

PLC在動(dòng)植物體內(nèi)表達(dá)量十分有限，且提取和分離過(guò)程繁瑣，成本高。微生物來(lái)源，特別是經(jīng)重組后的基因工程菌來(lái)源的PLC具有生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)也面臨一些不可回避的問(wèn)題，如：產(chǎn)PLC的原始菌株大多是致病菌，應(yīng)用在食品方面存在安全隱患；相較于傳統(tǒng)的酸法脫膠，酶法脫膠仍然面臨成本較高的問(wèn)題，若能實(shí)現(xiàn)PLC的有效固定化可以大大降低油脂精煉的成本；另外，普通微生物來(lái)源的PLC對(duì)酸和熱的耐受性均不理想，大大限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，故需要篩選或改造出具有更強(qiáng)耐酸和耐熱性能的PLC。?

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述和/或現(xiàn)有酶基因工程和酶工程領(lǐng)域中存在的問(wèn)題，提出了本發(fā)明。?

因此，本發(fā)明其中一個(gè)目的是提供一種重組大腸桿菌。?

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種重組大腸桿菌BL21（DE3）-pET28a-Sa-PLC，保藏編號(hào)為CCTCC?No.M2013300。?