[發明專利]肺癌靶向CHRNA5基因的shRNAs表達載體的構建、篩選及其用途

有效

• 申請號: 201310285339.6
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN103361379A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 馬曉麗;郟雁飛;肖東杰;賈穎;祖珊珊;趙云;韓淑毅;汪運山
• 申請（專利權）人: 汪運山
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00;A61P11/00
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及表達CHRNA5（cholinergic?receptor?nicotinic?alpha5）基因的肺癌的基因治療藥物，具體涉及靶向肺癌CHRNA5基因的shRNAs表達載體的構建、篩選及其用途，屬于生物醫藥技術領域。?

背景技術

肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率已占癌癥死亡率之首。煙草中的尼古丁是公認的引起肺癌發生的最重要的致癌因素之一，但其確切機理尚未明了。煙堿型乙酰膽堿受體（Nicotinic?Acetylcholine?Receptor,nAChR）信號途徑是近年來肺癌靶向研究的熱點之一。2008年,Nature和Nat?Genet上的三項獨立分子流行病學研究相繼報道，位于15號染色體長臂的nAChR基因簇CHRNA5/A3/B4的變異與肺癌和吸煙行為密切相關，其中，編碼α5-nAChR的CHRNA5基因與肺癌發生尤為相關。我們前期研究發現，α5-nAChR在肺癌組織中高表達，且與尼古丁促肺癌細胞的增殖、粘附及遷移，初步表明α5-nAChR與煙草相關的肺癌發生密切相關，參見CHRNA5Variants?Related?to?Nicotine?Sensitivity?in?Lung?Cancer?in?Vitro.BMEI'10,2010。?

近年研究證實，全身許多細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞、脂肪細胞、角質細胞、內皮細胞及腸道和肺的上皮細胞均表達nAChR，nAChR的上調或下調可對心血管系統、呼吸系統、內分泌系統及中樞神經系統產生生理學效應。尼古丁與肺癌細胞表面的nAChRs受體蛋白結合，促進肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管新生；同時誘導凋亡抑制基因，抑制肺癌細胞凋亡。尼古丁對呼吸系統的各種效應是基于nAChRs在肺上皮細胞的廣泛分布，但nAChRs在不同效應中的主要作用亞基尚不清楚，全基因組關聯(GWAS)分析等研究表明，編碼α5-nAChR的CHRNA5基因變異與肺癌發生密切相關，α5-nAChR與吸煙相關性肺癌具有特異性，CHRNA5可能是肺癌發生的候選基因。研究報道，CHRNA5mRNA在肺腺癌中的表達高于正常肺組織，且CHRNA5的表達與其基因變異相關，表明CHRNA5可能在肺癌發生的過程中起到重要作用。帶有CHRNA5基因變異的實驗鼠所吸收的尼古丁量明顯高于正常實驗鼠，表明CHRNA5基因影響機體對尼古丁的吸收。通過阻斷在肺癌細胞中CHRNA5的表達，進而影響其生物活性，同時結合其它治療手段可能是治療高表達CHRNA5肺癌的新策略。?

shRNA：小發卡或短發卡RNA（a?small?hairpin?RNA?or?shorthairpin?RNA,shRNA）是一段具有緊密發卡環（tight?hairpin?turn）的RNA序列，常被用于RNA干擾沉默靶基因的表達。利用載體把shRNA導入細胞，載體中的U6啟動子確保shRNA總是表達；裝載了shRNA載體可被傳遞到子代細胞中去，從而使基因的沉默可被遺傳。shRNA的發卡結構可被細胞機制切割成siRNA，然后siRNA結合到RNA誘導沉默復合物上（RNA-induced?silencing?complex，RISC），該復合物能夠結合到目的mRNAs并將其降解。?

RNA干擾作用分子小干擾RNA(small?interfering?RNA,siRNA)可與RNA誘導沉默復合體（RNA-induced?silencing?complex，RISC）結合，脫去一條鏈，然后和RISC一起與靶mRNA上的相應的堿基序列配對結合。在RISC作用下，特異性降解靶基因mRNA，3’端序列在細胞質中被酶降解，siRNA與RISC的復合體脫離被破壞的靶mRNA，繼續切割其他的靶mRNA。剩下的5’端在RNA依賴性RNA多聚酶（RNA-dependent?RNA?polymerase,RdRP）作用下生成互補鏈，新生的dsRNA會在Dicer酶的作用下生成更多的siRNA，繼續誘導靶mRNA沉默。如此循環使得在一段時間內，目標mRNA的蛋白質表達受到抑制，一般可維持96－120小時或3－4個細胞周期。近來Brummelkamp等發現通過向細胞質導入可以表達siRNA的質粒，可以使RNA干擾穩定地維持2個月，參見Brummelkamp?T?R,Bernards?R,Agami?R.A?system?for?stable?expression?of?short?interfering?RNAs?in?mammalian?cells.Science,2002,296(5567)550-553。?