[發(fā)明專(zhuān)利]肺癌靶向CHRNA5基因的shRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310285339.6
• 申請(qǐng)日: 2013-07-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103361379A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬曉麗;郟雁飛;肖東杰;賈穎;祖珊珊;趙云;韓淑毅;汪運(yùn)山
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 汪運(yùn)山
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00;A61P11/00
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.靶向CHRNA5基因的shRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pLLU2G為載體，針對(duì)人尼古丁乙酰膽堿受體α5基因（CHRNA5）編碼區(qū)上、下游的兩段序列，在較高表達(dá)CHRNA5的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中發(fā)揮RNA干擾作用；CHRNA5特異性RNA干涉靶序列分別為：①5'－GTCTTCTATCTTCCTTCAAAT－3’，起始于1101位；②5'－GCAGGTGTTTAATGCCATTTA－3’，起始于3472位，由以下方法制得：

（1）RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成

選擇CHRNA5基因編碼區(qū)的兩段序列①5'－GTCTTCTATCTTCCTTCAAAT－3’、②5'－GCAGGTGTTTAATGCCATTTA－3’，設(shè)計(jì)、合成兩對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下：

①shCHRNA5寡核苷酸序列1：

正義鏈:

5'-TGTCTTCTATCTTCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGAAGATAGAAGACTTTTTC-3'

反義鏈：

5'-TCGAGAAAAAGTCTTCTATCTTCCTTCAAATCTCGAGATTTGAAGGAAGATAGAAGACA-3’

②shCHRNA5寡核苷酸序列2：

正義鏈:

5'-TGCAGGTGTTTAATGCCATTTACTCGAGTAAATGGCATTAAACACCTGCTTTTTC-3'

反義鏈：

5'-TCGAGAAAAAGCAGGTGTTTAATGCCATTTACTCGAGTAAATGGCATTAAACACCTGCA-3’，

（2）合成的寡核苷酸分別與線(xiàn)性載體pLLU2G連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取

將步驟（1）合成的序列1的一對(duì)shCHRNA5寡核苷酸等量混勻，95℃作用2分鐘后慢慢冷卻至室溫，得到結(jié)合的雙鏈寡核苷酸shCHRNA5-1；

將步驟（1）合成的序列2的一對(duì)shCHRNA5寡核苷酸等量混勻，95℃作用2分鐘后慢慢冷卻至室溫，得到結(jié)合的雙鏈寡核苷酸shCHRNA5-2；

然后將上述雙鏈寡核苷酸shCHRNA5-1、shCHRNA5-2分別與pLLU2G質(zhì)粒載體連接得到pLLU2G-shCHRNA5-1或pLLU2G-shCHRNA5-2，最后分別轉(zhuǎn)化到stb13細(xì)菌；

（3）質(zhì)粒的鑒定

將步驟（2）提取的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用引物測(cè)序正向引物和測(cè)序反向引物進(jìn)行PCR鑒定，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測(cè)序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pLLU2G質(zhì)粒中。

2.權(quán)利要求1的靶向CHRNA5基因的shRNAs表達(dá)載體在制備治療表達(dá)CHRNA5的肺癌的基因藥物中的應(yīng)用。