[發(fā)明專利]一種高表達SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310285219.6
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN104278056A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊潔;高星杰;魏民新;王鑫廷;段中潮;辛靈彪
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高表達SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法。

背景技術(shù)

SND1（staphylococcal?nuclease?domain?containing?1）蛋白，又稱p100蛋白，?Tudor-SN?（tudor?staphylococcal?nuclease），首次作為EBNA2?（Epstein-Barr?virus?nuclear?protein?2，EB病毒細胞核抗原2）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，SND1蛋白廣泛表達于人、牛、小鼠、大鼠及斑馬魚等物種中，可參與基因轉(zhuǎn)錄、剪接體加工、細胞增殖、細胞應(yīng)激、RNA干擾、病毒感染等多種重要的細胞生物學(xué)事件。

SND1蛋白由N端四個重復(fù)葡萄球菌核酸酶樣（Staphylococcal?nucleases-like，SN-like）的SN（1~4）結(jié)構(gòu)域及C端的SN5a-Tudor-SN5b（TSN）結(jié)構(gòu)域組成。SND1-TSN包含4個α-螺旋、9個β-折疊和14個連接環(huán)，其中β（1~2）折疊參與SN5a（679–703）的構(gòu)成，大部分α1-螺旋和β（3~6）折疊形成典型的β-桶狀tudor（704–793）結(jié)構(gòu)域，β（7~9）-折疊和α（2~4）螺旋參與SN5b（794–895）的構(gòu)成。Tudor結(jié)構(gòu)域具有負電荷表面，還包含一個由保守的3個酪氨酸（Tyr721、Tyr738、Tyr741）及1個苯丙氨酸（Phe715）殘基組成的芳香族籠子，其可以鉤住富含尿嘧啶的小核核糖核蛋白體（Uridine-rich?small?nuclear?ribonucleo-proteins，U?snRNPs）的甲基化基團，而將其錨定于剪接體（spliceosome）上。另外，SND1蛋白的三維模型發(fā)現(xiàn)SN（1~4）結(jié)構(gòu)域具有正電荷表面，而SN4具有與TSN相似的可能參與蛋白結(jié)合作用的負電荷表面。SND1蛋白的SN3、SN4、Tudor-SN5結(jié)構(gòu)域聚集在一起形成新月狀結(jié)構(gòu)，其SN3、SN4所形成的凹陷型堿性表面是RNase活性位點上檸檬酸鹽離子的結(jié)合部位，可像夾子一樣特異性地結(jié)合并降解處于高編輯（hyper-edited）狀態(tài)的含有IU、UI的雙鏈microRNA前體。

多功能SND1蛋白具有較為廣泛且重要的生物學(xué)作用，其中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都有可能引起一定的臨床疾病。陸續(xù)有文獻報道SND1蛋白與哮喘、過敏、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、乳腺癌等多種人類疾病相關(guān)。比如，SND1蛋白可通過NF-κB/mir221途徑促進人類肝細胞癌的腫瘤血管生成。寡居核苷酸微陣列基因表達分析發(fā)現(xiàn)人類結(jié)腸腺癌SND1基因表達上調(diào)。SND1蛋白在結(jié)腸癌早期表達升高，并通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制腺瘤狀結(jié)腸息肉蛋白（adenomatous?polyposis?coli?protein,?APC）的表達，影響細胞的接觸抑制、極化、增殖等，在結(jié)腸癌早期形成過程中發(fā)揮著重要的作用。對比腎細胞癌與正常腎組織的基因表達譜微陣列分析發(fā)現(xiàn)非編碼基因的轉(zhuǎn)錄在腎組織中較普遍，并且若干腫瘤相關(guān)的編碼與非編碼基因轉(zhuǎn)錄水平在腎細胞癌組織中均顯著下調(diào)。在腎透明細胞癌（Clear?Cell?Renal?Carcinoma）的基因表達中，SND1的非編碼基因轉(zhuǎn)錄本明顯下調(diào)，推測SND1可能通過非編碼基因調(diào)控方式來影響STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而參與腎癌的發(fā)生與發(fā)展。另外，SND1蛋白高表達于復(fù)發(fā)的雄激素非依賴型前列腺癌組織中，有望成為前列腺癌的生物診斷標記和臨床治療靶點。早期腫瘤SND1蛋白的高表達與臨床乳腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率呈正相關(guān)。SND1可與一種介導(dǎo)癌細胞遠程轉(zhuǎn)移的Metadherin（或稱MTDH3、Lyric、AEG1）蛋白結(jié)合，通過調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移和化學(xué)耐受相關(guān)基因（ALDH3A1和KiSS1）的表達，促進小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。SND1還與Metadherin蛋白在結(jié)腸癌中共同高表達，有望成為結(jié)腸癌早期診斷的新靶點。本發(fā)明提供的高表達SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備方法方便研究SND1蛋白在腫瘤增殖、遷移等過程中的作用機制，為臨床腫瘤疾病的診療提供研究平臺。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是解決如何在小鼠等動物體內(nèi)研究多功能SND1蛋白的功能機制問題，提供一種高表達SND1-FLAG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法。小鼠SND1基因定位于染色體6A3.3，這里我們針對小鼠SND1-FLAG基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，有助于從動物水平深入研究此多功能蛋白。

本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的具體構(gòu)建過程如下：

第1步、pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建：