[發明專利]檢測大腸桿菌致病血清型的引物及檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310284445.2
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN103305626A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 張雪寒;何孔旺;葉青;汪偉;倪艷秀;溫立斌;李彬;周俊明;王小敏
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

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一、技術領域

本發明涉及檢測大腸桿菌致病血清型的引物及檢測試劑盒，屬于生物和食品領域。

二、背景技術

能夠導致人類腹瀉的大腸桿菌依據它們毒力因子特性以及致病機制分為不同的致病型。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸聚集大腸桿菌（EAEC）、腸侵染性大腸桿菌（EIEC）是其中非常重要的五種致病型。這些致病型的大腸桿菌基本上都能夠產生志賀毒素，故又稱為產志賀毒素大腸桿菌（STEC）。?STEC是最重要的食源性病原菌，能夠導致人類嚴重的疾病，諸如出血性腸炎（HC）和溶血尿毒綜合征（HUS）等，個別患者可因急性和慢性腎功能衰竭而死亡。動物感染一般不引發明顯的臨床癥狀，但能夠長期甚至終生攜帶。污染的肉品、奶制品以及蔬菜等食物是傳播STEC主要的媒介。

人源和動物源的STEC可以產生兩種毒素，分別為志賀毒素1（Stx1）和志賀毒素2(Stx2)，是引發HC和HUS的主要元兇。攜帶Stx2的STEC明顯高于Stx1，并且Stx2能夠分泌到菌體外，有著更嚴重的致病作用。Stx2有多個亞型Stx2c、Stx2d、Stx2e、Stx2f和stx2v，與菌株血清型和致病性有著密切關系。?

緊密素（intimin）是僅次于志賀毒素具有極強致病力的毒力因子，主要介導STEC在腸上皮細胞的定植，促進肌動蛋白聚合和基座樣結構形成，造成嚴重的腸絨毛脫落，即A/E損傷。Intimin編碼基因為eae，有27個亞型α1、α2、β1、β2、β3、ε1、ε2、ε3、ε4、η1、η2、θ、λ、μ、ν、ξ1、ξ3、ο、π、ρ、σ、τ1、τ2、б、γ1、γ2和κ，與菌株血清型和致病性有著密切關系。?

????建立能夠快速而特異的檢測致病性大腸桿菌的方法勢在必行。隨著抗生素的泛濫使用、導致菌株毒力基因更多變異，加之人類飲食結構的改變，更加重視食物營養的保留，食物被致病性大腸桿菌污染的幾率增高、人類感染的機會也會隨之更頻繁。因此，選擇stx2和eae兩個基因設計引物，兼顧基因的多個亞型，建立二重PCR方法，鮮見報道。組裝試劑盒，便于推廣和使用。?

三、發現內容

技術問題??本發明目的在于建立能夠檢測大腸桿菌主要致病血清型的方法，進而組裝成試劑盒，廣泛推廣和使用。本發明在基因選擇和引物設計上注重通用性和簡并性，擴增主要毒力基因stx2和eae以及它們的多個亞型，為致病性大腸桿菌的監測提供可靠的技術手段。

技術方案??本發明的具體實施方案如下：?

（1）引物設計

根據GenBank登陸的stx2、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f和stx2v多個亞型基因序列設計通用引物，能夠同時擴增出stx2主要的6個基因亞型，其上、下游引物序列分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2；根據GenBank登陸的eaeα、eaeα2、eaeβ、eaeβ2、eaeβ3、eaeε、eaeε2、eaeε3、eaeε4、eaeη、eaeη2、eaeθ、eaeλ、eaeμ、eaeν、eaeξ、eaeο、eaeπ、eaeρ、eaeσ、eaeτ、eaeτ2、eaeб、eaeγ、eaeγ2和eaeκ多個基因亞型序列設計通用引物，能夠同時擴增出eae多個亞型緊密素(eae)基因，其上、下游引物序列分別為SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。引物序列如下：

SEQ?ID?NO.1：5-?tcatcatatctggcgttaatgga-3??????????????????

SEQ?ID?NO.2：5-?tgtcgccagttatctgacattct-3??????????????????

SEQ?ID?NO.3：5-ctggtgataatacccgtttagg-3??????????????

SEQ?ID?NO.4：5-atccagaccgtatttgctctta-3??

（2）上述引物制備的試劑盒用檢測大腸桿菌主要致病血清型的二重PCR方法，包括以下步驟：

①?待檢模板的制備：糞便或者食物10克，打散或者研磨加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，37℃培養18小時，吸取1mL培養物，500?轉離心10分鐘，棄沉淀，吸取上清至新的離心管，12000轉離心2分鐘，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10分鐘，4℃12000轉?離心10分鐘，吸取上清，即檢測用模板DNA。