[發(fā)明專利]檢測大腸桿菌致病血清型的引物及檢測試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310284445.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN103305626A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雪寒;何孔旺;葉青;汪偉;倪艷秀;溫立斌;李彬;周俊明;王小敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.檢測大腸桿菌致病血清型的引物：

志賀毒素2即stx2基因的檢測上、下游序列分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2；

緊密素即eae基因的檢測上、下游序列分別為SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4；

SEQ?ID?NO.1：5-?tcatcatatctggcgttaatgga-3??????????????????

SEQ?ID?NO.2：5-?tgtcgccagttatctgacattct-3??????????????????

SEQ?ID?NO.3：5-ctggtgataatacccgtttagg-3??????????????

SEQ?ID?NO.4：5-atccagaccgtatttgctctta-3

其中stx2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為388bp，eae基因的擴(kuò)增產(chǎn)物為609bp。

2.含有權(quán)利要求1所述引物的檢測大腸桿菌致病血清型的試劑盒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其用于檢測大腸桿菌致病血清型毒力基因stx2和eae的二重PCR方法，包括以下步驟：

（1）待檢模板的制備：糞便或者食物10克，打散或者研磨加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，吸取1mL培養(yǎng)物，500?轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄沉淀，吸取上清至新的離心管，12000轉(zhuǎn)離心2分鐘，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10分鐘，4℃12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸取上清，即檢測用模板DNA；

（2）將stx2?上下游和eae上下游引物按照摩爾比1:2.5與PCR混合液一同加入到PCR反應(yīng)管中，混合后加入待檢樣品DNA；

PCR混合液包括：采用25?uL的PCR反應(yīng)體系，在0.2?mL的PCR反應(yīng)管中分別加入10×PCR緩沖液2.5uL、2.5mM的dNTPs?2.0uL、25mM的MgCl₂?1.5?uL、濃度為50pmol/uL?的stx2上下游引物各0.2?uL、濃度為50pmol/uL?的eae上下游引物各0.5?uL，5U/?uL?DNA聚合酶0.5?uL、DNA模板5?uL、用滅菌超純水加至總體積，混勻；

（3）將PCR管至于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，94℃?30秒，57℃?30秒，72℃?40秒，29個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5分鐘；

（4）將PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比為1%的瓊脂糖凝膠上電泳；

（5）結(jié)果判定：

擴(kuò)增產(chǎn)物如果有一條帶388bp或609bp?，或者兩條帶388bp和609bp，即表示有大腸桿菌主要致病血清型的存在；

擴(kuò)增產(chǎn)物如果沒有條帶388bp或609bp?，即表示無大腸桿菌主要致病血清型的存在。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，陽性模板200?uL、PCR混合液1mL、陰性對(duì)照200?uL，陽性模板為含有stx2和eae基因的大腸桿菌O157:H7基因組，濃度為0.63mg/mL。