[發明專利]一種制備重組人源血管內皮生長因子VEGF165的方法

有效

• 申請號: 201310283384.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103451220B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 錢永常
• 申請（專利權）人: 杭州紐龍日尚生物制品有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/515;C07K1/18
• 代理公司: 北京德琦知識產權代理有限公司11018
• 代理人: 康泉,王珍仙

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及重組人源血管內皮生長因子VEGF165蛋白的制備方法。

背景技術

血管內皮生長因子(Vascular?endothelial?growth?factor，VEGF)又稱血管通透因子(Vascular?permeability?factor，VPF)，是一種特異性作用于內皮細胞的多功能因子，作為特異的內皮細胞有絲分裂素，它是最主要的血管生成因子。它不僅與胚胎發育、創傷修復、骨形成改建等生理性過程有關，而且參與心血管疾病、缺血缺氧性疾病等病理性血管形成過程，尤其與腫瘤新生血管的形成、生長、浸潤、轉移等密切相關。

VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白。由于mRNA不同的剪切方式，產生了VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5種蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管內皮細胞促進其增殖，增加血管的通透性。VEGF165是人類組織中VEGF主要的基因產物，也是VEGF家族中最重要的血管生成調節因子。

隨著VEGF在癌癥藥物研發中變得越來越重要，市場上對有生物活性的VEGF的需求也越來越大。由于VEGF在人體血液中含量不高，來源非常有限，導致其提取難度大、產量甚微，遠遠不能滿足需要，因此，利用基因重組技術大量生產有生物活性的VEGF勢在必行。

利用基因工程技術、以微生物為載體生產外源蛋白具有廣闊的應用前景。到目前為止，已經發展了多種蛋白表達系統。大腸桿菌表達系統是研究的最清楚的一套原核表達系統，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高、表達產物分離純化相對簡單以及適于工業化生產等優點，其應用非常廣泛。

但是常規的用大腸桿菌表達VEGF的系統中，rh-VEGF165通常含有標簽，標簽的加入影響了rh-VEGF165的生物活性，而且由于需要用腸激酶切除標簽的步驟，使蛋白的提純步驟更加復雜，從而增加了生產成本。

發明內容

為解決上述問題，本申請構建了不含有標簽的rh-VEGF165表達系統，避免了純化標簽對rh-VEGF165生物活性的影響，本發明所獲得的rh-VEGF165蛋白生物活性為1.76ng/ml，同sigma公司最優級VEGF165的生物活性相當，說明本發明獲得的rh-VEGF165具有同天然VEGF165基本一致的蛋白構象。此外，本發明制備的rh-VEGF165用陰離子交換柱純化的效果明顯優于CM柱和鎳柱的純化效果，并且簡化了步驟，節省了成本。

本發明提供了一種制備并純化重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的方法，該方法包括步驟①構建用于表達不帶標簽的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的表達載體；②利用所述表達載體通過表達系統表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165；和③分離并用陰離子交換柱純化所述表達系統中表達的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165。

上述技術方案構建了不含有標簽的rh-VEGF165表達系統，避免了純化標簽對rh-VEGF165生物活性的影響，同時用陰離子交換柱純化簡化了純化的步驟，節省了成本。

在一些實施方式中，所述表達系統包括大腸桿菌。

在一些實施方式中，所述方法進一步包括復性步驟，所述復性步驟包括利用包涵體復性液復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體。

在一些實施方式中，所述包涵體復性液包含濃度大于等于2mM的GSSG和濃度大于等于1mM的DTT，并且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小于1。在一些實施方式中，所述包涵體復性液包含2mM至10mM的GSSG和1mM至5mM?DTT，并且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例優選地大于等于1∶2.5并且小于等于1∶1.5。優選地，所述包涵體復性液包含2mM的GSSG和1mM?DTT。

在一些實施方式中，步驟①中表達載體選擇pET-28a(其圖譜見圖1)，并且克隆rh-VEGF165基因的插入位點為Nco?I和Xho?I酶切位點。在一些實施方式中，克隆rh-VEGF165基因的上游引物和下游引物分別為TACATG?CCATGG?CACCCATGGC?AGAAGGAG(下劃線為NcoI酶切位點)和ATACCG?CTCGAGTTATCACCGC?CTCGGCTTGT?C(下劃線為XhoI酶切位點)。