[發明專利]一種制備重組人源血管內皮生長因子VEGF165的方法

有效

• 申請號: 201310283384.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103451220B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 錢永常
• 申請（專利權）人: 杭州紐龍日尚生物制品有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/515;C07K1/18
• 代理公司: 北京德琦知識產權代理有限公司11018
• 代理人: 康泉,王珍仙

1.一種制備重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的方法，該方法包括步驟：

①構建用于表達不帶標簽的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的表達載體；

②利用所述表達載體通過表達系統表達重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165；和

③分離并用陰離子交換柱純化所述表達系統中表達的重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165。

2.如權利要求1所述的制備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述表達系統包括大腸桿菌。

3.如權利要求1或2所述的制備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，進一步包括復性步驟，所述復性步驟包括利用包涵體復性液來復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體，其中，所述包涵體復性液中包含濃度大于等于2mM的GSSG和濃度大于等于1mM的DTT，并且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小于1，優選大于等于1∶2.5并且小于等于1∶1.5。

4.如權利要求3所述的制備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述包涵體復性液包含2mM至10mM的GSSG和1mM至5mM的DTT。

5.如前述任一項權利要求所述的制備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述表達載體為pET-28a，優選其中克隆rh-VEGF165基因的插入位點為Nco?I和Xho?I酶切位點。

6.如權利要求5所述的制備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，克隆rh-VEGF165基因的上游引物和下游引物分別為TACATGCCATGG?CACCCATGGCAGAAGGAG和ATACCGCTCGAGTTATCACCGCCTCGGCTTGTC。

7.如前述任一項權利要求所述的制備重組人源血管內皮生長因子蛋白質的方法，其中，所述陰離子交換柱為DEAE柱，并且進行DEAE柱純化之前僅進行一次透析。

8.一種重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的復性方法，所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165不帶任何表達標簽，所述復性方法包括利用包涵體復性液復性重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165蛋白質的包涵體，其中，所述包涵體復性液包括濃度大于等于2mM的GSSG和濃度大于等于1mM的DTT，并且DTT與GSSG的摩爾濃度的比例小于1，優選地大于等于1∶2.5并且小于等于1∶1.5。

9.一種重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165的純化方法，所述重組人源血管內皮生長因子rh-VEGF165不帶任何表達標簽，所述方法包括用陰離子交換柱純化重組人源血管內皮生長因子蛋白質。

10.如權利要求9所述的方法，其中所述陰離子交換柱為DEAE柱，并且進行DEAE柱純化之前僅進行一次透析。