[發明專利]一種丙氧酚人工抗原的制備方法

有效

• 申請號: 201310283134.4
• 申請日: 2013-07-05
• 公開（公告）號: CN103360487A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 邵越水;徐建
• 申請（專利權）人: 杭州博林生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，具體涉及一種丙氧酚人工抗原的制備方法。

背景技術

丙氧酚（propoxyphene）又叫右丙氧酚，是常用的阿片類止痛藥之一，用于治療輕度至中度疼痛，與其他鎮痛藥相比，右丙氧酚有起效快的特點。其結構式為：

大劑量服用丙氧酚可發生吞咽困難、幻視及中毒性精神病，可能引起呼吸抑制。急性過量可產生多系統癥狀，如痙攣、幻覺、精神錯亂，甚至昏迷、呼吸抑制、呼吸停止、心動過速、血壓高或血壓低、心臟傳導障礙，甚至心臟停搏。FDA有報告顯示，222例的死亡率為8%，并提出30歲以下患者以呼吸抑制為多見，而老年人多見有心臟毒性作用。據專家介紹，右丙氧酚屬于二類精神藥物，已經被列入麻醉藥品管理目錄了。

目前，對丙氧酚的檢測主要依靠高效液相色譜法（HPLC）,氣相色譜（GC），薄層色譜（TLC），質樸（MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費時，并且需要專業技術人員進行操作，不能達到現代檢測對快速，準確的要求。而免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一種利用抗原抗體特異性結合反應檢測各種物質（藥物、激素、蛋白質、微生物等）的分析方法,?該方法的前提就是需要提供特異性的抗原和抗體。因此有必要提供一種有效的丙氧酚人工抗原的制備方法,制備的丙氧酚人工抗原可用于免疫制備具有特異性的丙氧酚抗體,進一步用于檢測。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷與不足，提供一種丙氧酚人工抗原的制備方法，所制備的丙氧酚人工抗原可進行動物免疫，取得相應的丙氧酚抗體，可用于各種丙氧酚類免疫分析法的研究，為丙氧酚的檢測提供更加方便快速準確的途徑。

一種丙氧酚人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)?制備人工半抗原：

(a)?將(2S,3R)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇和戊二酸酐以摩爾比為1：10加入圓底燒瓶中，100℃下攪拌反應72小時后，減壓蒸干溶劑，殘渣用氫氧鈉水溶液逐步溶解，再用飽和氫氧化鈉水溶液調pH=9，經乙酸乙酯洗滌后水相用鹽酸溶液調pH=1，二氯甲烷萃取，合并有機相，經干燥，過濾，減壓蒸餾得到棕褐色固體，薄層層析法純化得到丙氧酚半抗原；薄層層析：層析液體積比：95%乙醇︰1,4-二氧六環︰二氯甲烷︰氨水=8︰1︰10︰1；產物R_f?=0.3；

????(2)?制備丙氧酚人工抗原：

(b）將丙氧酚半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺、環己基碳酰二亞胺以摩爾比為1︰1.5︰1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室溫攪拌反應18小時，反應結束后離心取上清液記為A液；

(c)?將氯化鈉與十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉以摩爾比為78.3︰4.2︰1溶于雙蒸水中，制備鈉離子濃度為0.1mol/L的PBS緩沖液，pH為7.4；

(d)?將牛血清蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為10mg/ml的B液；

(e)?將A液緩慢滴加到B液，A液與B液的體積比為1︰10，得到的混合液在4℃條件下靜置保存過夜，得到人工抗原混合液；

(f)?將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，透析結束后離心取上清液即得到人工抗原：丙氧酚-牛血清蛋白。

由于丙氧酚的分子量較小，單獨作用時不具有免疫原性或免疫原性較弱，因此必須將其與大分子載體比如牛血清蛋白連接形成丙氧酚抗原后，才能刺激機體產生相應的丙氧酚抗體。本發明在制備丙氧酚人工抗原過程中，所選的位點和交聯方法都沒有明顯改變其結構，保留了抗原決定簇。在丙氧酚半抗原和牛血清蛋白之間引入橋結構，暴露抗原決定簇，所獲得的丙氧酚人工抗原保持了丙氧酚的結構特異性，有利于相應丙氧酚抗體的產生。

本發明的技術方案分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：以chirald（(2S,3R)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇）為原料，通過與戊二酸酐的縮合反應，在氮位上引入羧基得到含羧基的半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢測：通過碳二亞胺法使之與牛血清蛋白(BSA)結合制備丙氧酚的人工抗原即丙氧酚-牛血清蛋白。其反應方程式如下：

本發明制備得到的丙氧酚人工抗原可通過以下方法進行鑒定：