[發明專利]阿卡波糖工程菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310282654.3
• 申請日: 2013-07-05
• 公開（公告）號: CN103305544A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 黃雋;李美紅;余貞
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P19/26;C12N15/11;C12R1/045
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標代理有限公司 11012
• 代理人: 黃澤雄;陳悅軍

技術領域

本發明涉及一種利用基因工程方法構建的阿卡波糖工程菌，更具體地，涉及一種降低了C組分雜質的阿卡波糖工程菌、制備該工程菌的方法以及該工程菌的應用。

背景技術

據統計，目前我國糖尿病患者人數已達9240萬人，其中男性5020萬人，女性4220萬人。發病人數超過印度，成為世界糖尿病人最多的國家，發病率（9.7%）僅次于美國（11%）。此外，還有約1.5億人為糖尿病前期，每年治療費用就達到1740億元。

游動放線菌（Actinoplanes?sp.）產生的降糖藥阿卡波糖是II型糖尿病的首選治療藥物，國內年銷售額已近20億元。目前阿卡波糖在生產上主要存在雜質組分問題，嚴重影響產品質量；其中最為突出的是C組分雜質（Yvonne?Rockser,Udo?F.Wehmeier.The?gac-gene?cluster?for?the?production?of?acarbose?from?Streptomyces?glaucescens?GLA.O-Identification,isolation?and?characterization.Journal?of?Biotechnology，第140卷，第1-2期，2009年3月10日，114-123頁）。一般情況下，產品中對C組分雜質含量的要求是在0.1%以下，雜質含量不達標的產品不能進入銷售渠道。然而現有的由游動放線菌發酵工程生產的阿卡波糖中，C組分雜質含量普遍在2.5%以上。為保證產品質量，需要進行后續提純步驟，導致工藝復雜，生產成本提高。

目前使用較多的是通過控制發酵過程來控制雜質組分的含量，但是該方法不穩定。

根據文獻報導（ppl?Microbiol?Biotechnol(2008)80:767-778），產生阿卡波糖C組分雜質有兩條途徑：一是阿卡波糖經過treY基因編碼的麥芽寡糖基海藻糖合酶催化反應直接得到C組分雜質；二是由treS基因編碼的海藻糖酶合成海藻糖，再進入合成途徑得到C組分雜質。因此，通過基因重組的方法控制C組分雜質也是一種途徑。

利用接合轉移方法進行轉化的技術在鏈霉菌和其它一些放線菌中已廣泛應用，但在游動放線菌中鮮有報道，而且傳統的接合轉移方法對游動放線菌的轉化效率極低，不適合進行基因重組。例如，現有技術中，采用50℃熱擊10分鐘對大腸桿菌和放線菌進行接合轉移（Practical?Streptomyces?Genetics,2000,Tobias?Kieser等），但該溫度和時間對游動放線菌和大腸桿菌的接合轉移不適用。

發明內容

本發明的目的是提供一種阿卡波糖工程菌，使發酵產生的阿卡波糖C組分雜質顯著下降。

在第一個方面，本發明提供一種制備阿卡波糖工程菌的方法，所述方法是將生產阿卡波糖的游動放線菌中的treY基因滅活，所述treY基因的編碼序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述滅活是通過將DNA片段M導入到游動放線菌中，使DNA片段M與游動放線菌的treY基因發生同源重組而完成；所述同源重組是通過將游動放線菌的菌絲與導入所述DNA片段M的重組菌共同培養進行接合轉移而完成；

所述DNA片段M，自5’端到3’端分別為同源臂T1、DNA片段N和同源臂T2；所述同源臂T1和同源臂T2能夠與treY基因發生同源重組，滅活treY基因；所述片段N為連接片段。

優選地，所述同源臂T1與treY基因的上游序列同源重組；進一步優選地，所述同源臂T1包括treY基因編碼序列的5’端785bp核苷酸。

優選地，所述同源臂T2與treY基因的下游序列同源重組；進一步優選地，所述同源臂T2包括treY基因編碼序列的3’端930bp核苷酸。

優選地，所述片段N為包含限制性核酸內切酶識別序列的片段；進一步優選地，所述片段N包含BamHI酶識別序列。