[發明專利]阿卡波糖工程菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310282654.3
• 申請日: 2013-07-05
• 公開（公告）號: CN103305544A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 黃雋;李美紅;余貞
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P19/26;C12N15/11;C12R1/045
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標代理有限公司 11012
• 代理人: 黃澤雄;陳悅軍

1.一種制備阿卡波糖工程菌的方法，所述方法是將生產阿卡波糖的游動放線菌中的treY基因滅活；所述滅活是通過將DNA片段M導入到游動放線菌中，使DNA片段M與游動放線菌的treY基因發生同源重組而完成；所述同源重組是通過將游動放線菌的菌絲與導入所述DNA片段M的重組菌共同培養進行接合轉移而完成；優選地，所述游動放線菌是Actinoplanes?sp.SN223/29；進一步優選地，所述游動放線菌是游動放線菌8-22；

所述DNA片段M，自5’端到3’端分別為同源臂T1、DNA片段N和同源臂T2；所述同源臂T1和同源臂T2能夠與treY基因發生同源重組，滅活treY基因；所述片段N為連接片段。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA片段M中，所述同源臂T1與treY基因的上游序列同源重組；優選地，所述同源臂T1包括treY基因編碼序列的5’端785bp核苷酸；所述同源臂T2與treY基因的下游序列同源重組；優選地，所述同源臂T2包括treY基因編碼序列的3’端930bp核苷酸；所述片段N為包含限制性核酸內切酶識別序列的片段；優選地，所述片段N包含BamHI酶識別序列。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA片段M的序列如SEQ?ID?NO:3所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述導入DNA片段M的重組菌是將所述DNA片段M克隆至pUAmT14質粒的多克隆酶切位點而得到重組質粒pAT-tre12，再將重組質粒pAT-tre12轉化至大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中所得到的重組菌。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，在將重組菌與游動放線菌共同培養進行接合轉移之前，將所述游動放線菌以37℃水浴20分鐘。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法制備的阿卡波糖工程菌，其特征在于，所述工程菌中treY基因失活；優選地，所述阿卡波糖工程菌是游動放線菌tre12-2#。

7.根據權利要求6所述的阿卡波糖工程菌在制備阿卡波糖中的應用。

8.一種制備阿卡波糖的方法，其特征在于，所述方法使用權利要求6所述的阿卡波糖工程菌。

9.DNA片段M，其特征在于，所述片段M自5’端到3’端分別為同源臂T1、DNA片段N和同源臂T2；所述同源臂T1與treY基因的上游序列同源重組，優選地，所述同源臂T1包括treY基因編碼序列的5’端785bp核苷酸；所述同源臂T2與treY基因的下游序列同源重組，優選地，所述同源臂T2包括treY基因編碼序列的3’端930bp核苷酸；所述片段N為連接片段，包含限制性核酸內切酶識別序列，優選地，所述片段N包含BamHI酶識別序列；優選地，所述DNA片段M的序列如SEQ?ID?NO:3所示。

10.包含權利要求9所述的DNA片段M的質粒或重組菌，優選地，所述質粒是pAT-tre12；優選地，所述重組菌是將質粒pAT-tre12轉化至大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中所得到的重組菌。