[發明專利]多肽微陣列芯片在血漿中檢測凝血酶活性及篩選凝血酶抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201310282186.X
• 申請日: 2013-07-05
• 公開（公告）號: CN103361398A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 王振新;蘇敏
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C12Q1/56
• 分類號: C12Q1/56;G01N33/68
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所 22210
• 代理人: 王丹陽

技術領域

本發明涉及一種多肽微陣列芯片在血漿中檢測凝血酶活性及篩選凝血酶抑制劑的方法，屬于多肽微陣列芯片技術領域。

背景技術

凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，在凝血途徑中它一方面將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，促進血小板聚集，加速血液凝固，另一方面又激活抗凝機制，防止血栓形成。凝血酶的形成是整個凝血途徑中各因子相互作用的結果，低水平的凝血酶活性與出血有關，高水平的凝血酶活性與血栓前狀態相關(Thrombin?Functions?During?Tissue?Factor-Induced?Blood?CoaguLation,Blood,2002,100,148-152；ABriefHistoricalReviewoftheWaterfall/CascadeofBloodCoaguLation,J.Biol.Chem.,2003,278,50819-50832)。

血液凝結是一個受多種因子調控的復雜網絡過程，某一因子濃度的改變都會改變體系中其他因子的濃度。凝血酶活性檢測能更準確地反映凝血途徑中各因子的組合效應(In?Vivo?Imaging?of?Thrombin?Activity?in?Experimental?Thrombi?with?Thrombin-Sensitive?Near-Infrared?MolecuLar?Probe,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,2002,22,1929-1935)。現有分析化學技術中檢測血漿中的凝血酶多采用加標實驗，引入的凝血酶會改變體系中其他因子的濃度，從而導致凝血酶本身的濃度也發生改變，所以分析化學技術中凝血酶的檢測不適用于血液凝結環境。

多肽微陣列芯片技術是一種廣泛用于研究抗原表位分析，蛋白與底物的相互作用，細胞內含物與多肽的相互作用，以及小分子物質與蛋白的相互作用的高通量分析方法(Microarray-Based?Detection?of?Protein?Binding?and?Functionality?by?Gold?Nanoparticle?Probes，Anal.Chem.,2005,77,5770-5774)。但現有技術中，還沒有利用多肽微陣列芯片在血漿中檢測凝血酶活性和篩選凝血酶抑制劑的方法。

發明內容

為解決現有分析化學中檢測凝血酶的方法不適用于血液凝結環境中凝血酶的檢測及凝血酶抑制劑的篩選的技術問題，本發明提供一種多肽微陣列芯片在血漿中檢測凝血酶活性及篩選凝血酶抑制劑的方法。

本發明的多肽微陣列芯片在血漿中檢測凝血酶活性的方法，包括以下步驟：

(1)將多肽微陣列芯片與激活的血漿在36-38°C反應40min以上，得到反應后的多肽微陣列芯片；

所述多肽微陣列芯片以生物素修飾的多肽為底物，所述多肽的氨基酸序列為Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg-Val-Val-Lys，Cys-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Val-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg-Val-Val-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Phe-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg-Val-Val-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-Val-Pro-Arg-Ser-Phe-Lys-Val-Val-Lys，Cys-Gly-Gly-Gly-Ala-Arg-Pro-Arg-Ser-Leu-Leu-Val-Gly-Lys，Cys-Ala-Glu-Gly-Gly-D-Phe-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg-Val-Val-Lys或者Cys-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Phe-Asp-Lys，其中，生物素均修飾在末端賴氨酸上，D-Phe為D型苯丙氨酸，其它氨基酸均為L型氨基酸；

(2)將反應后的多肽微陣列芯片與親和素(avidin)反應1h以上，再與多肽修飾的金納米粒子反應1h以上，得到金納米粒子標記的多肽微陣列芯片；

所述多肽修飾的金納米粒子為Cys-Ala-Leu-Asn-Asn與Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly修飾的金納米粒子，其中，Lys上修飾有生物素；

(3)檢測金納米粒子標記的多肽微陣列芯片上金納米粒子的共振光散射信號，實現對凝血酶活性的檢測。