[發(fā)明專利]小分子化合物Antagomir-31制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310281426.4
• 申請(qǐng)日: 2013-07-05
• 公開（公告）號(hào): CN104278030A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王宏林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/10;A61K48/00;A61P37/02;A61P17/06
• 代理公司: 上海大邦律師事務(wù)所 31252
• 代理人: 袁洋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及小分子化合物Antagomir-31的制備方法及在制備免疫調(diào)節(jié)功能藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療銀屑病藥物中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

銀屑病（psoriasis）是一種常見的免疫相關(guān)性、復(fù)發(fā)性的慢性炎癥性皮膚病，其特征是真皮內(nèi)濃密的以T細(xì)胞、DC、自然殺傷T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤。銀屑病患者皮膚的表皮過度增生且無法正常分化，使其表皮顯著增厚、結(jié)痂增多。銀屑病的確切發(fā)病原因還不明確，環(huán)境因子（諸如感染、外傷、壓力等）和遺傳因子等綜合因素決定了個(gè)體的易感性。銀屑病目前尚無根治的藥物，早期治療多使用類固醇等非生物性的免疫抑制劑，此類非專一性免疫抑制劑具有相當(dāng)程度的副作用。近年來，生物制劑如腫瘤壞死因子制劑Etanercept（依那西普）等也被用于銀屑病治療，此類藥物多為人源化抗體，用于阻隔銀屑病相關(guān)炎癥細(xì)胞因子與受體間的作用。由于許多炎癥細(xì)胞因子在機(jī)體正常免疫反應(yīng)中不可缺少，沒有選擇性地阻擋炎癥細(xì)胞因子亦會(huì)導(dǎo)致用藥后的副作用，停藥后疾病容易反彈。此外，抗體類藥物生產(chǎn)成本高、價(jià)格昂貴、普通病人很難能承受。從1984年以來我國約有超過400萬患者被診斷為銀屑病，自主研究開發(fā)我國有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療銀屑病的新藥物勢(shì)在必行。?

MicroRNA（miRNAs）是一種大小約21-23?bp的單鏈小分子RNA。由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體microRNA（70-90?bp）經(jīng)Dicer酶加工后生成。小分子microRNA通過與目標(biāo)基因mRNA的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，從而在真核基因的表達(dá)調(diào)控過程中起著重要的作用。科學(xué)家們相繼發(fā)現(xiàn)在銀屑病患者的皮膚和正常人皮膚中，有一些microRNA的表達(dá)存在非常顯著的差異。這些小分子microRNA中有一些已經(jīng)被證實(shí)調(diào)控著銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。比如miR-203，miR-125b，miR-424和miR-99a都促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增值和分化。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，microRNA-31在小鼠類銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演者重要的角色：microRNA-31高表達(dá)，小鼠類銀屑病發(fā)病明顯嚴(yán)重于對(duì)照小鼠；反之，小鼠類銀屑病發(fā)病減緩。?

小分子化合物Antagomir-31是一種根據(jù)microRNA-31成熟體序列而設(shè)計(jì)，經(jīng)過一系列的修飾和標(biāo)記的單鏈RNA，對(duì)內(nèi)源性microRNA-31具有高效的阻斷作用。它具有以下幾個(gè)作用特點(diǎn)：1.高特異性阻斷內(nèi)源性microRNA-31；2.有效抑制microRNA-31，可引起內(nèi)源性microRNA-31的降解;3.可循環(huán)作用，抑制持續(xù)時(shí)間長，最長可持續(xù)數(shù)周時(shí)間；4.可作用在細(xì)胞水平和動(dòng)物整體。小分子化合物Antagomir-31易于合成且對(duì)microRNA-31抑制效果明顯。使用小分子化合物Antagomir-31治療銀屑病實(shí)屬可行性高、用途廣、侵入性小、且具經(jīng)濟(jì)效益的選擇。小分子化合物Antagomir-31抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中microRNA-31的表達(dá)。然而小分子化合物Antagomir-31在銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制目前尚未見報(bào)道，本發(fā)明將就此問題進(jìn)行研究。?

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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種小分子化合物Antagomir-31在制備抑制細(xì)胞增殖功能藥物、制備具有免疫調(diào)節(jié)功能及制備治療銀屑病的藥物中的應(yīng)用的藥物中的應(yīng)用。?

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本發(fā)明的技術(shù)方案是：

該小分子化合物Antagomir-31的合成方法，包括以下步驟：

1）?根據(jù)成體microRNA-31的序列合成寡核苷酸單鏈，長度在23個(gè)bp；

2）?用標(biāo)準(zhǔn)的固相亞磷酰胺合成方法將Quasar-570結(jié)合到寡核苷酸5’端獲得熒光標(biāo)記；

3）?以5-乙硫基四唑?yàn)榛罨瘎跐舛葹?.1M的乙腈中延長反應(yīng)15分鐘以完成寡核苷酸的末端封閉反應(yīng)、氧化反應(yīng)和去保護(hù)作用；

4）?用HPLC純化產(chǎn)物，流動(dòng)相為含有10%含有20?mM?NaOAC的乙腈（溶劑A）和70%含有20?mM?NaOAC的乙腈（溶劑B）；

5）?3’進(jìn)行膽固醇（cholesterol）標(biāo)記；

6）?5’兩個(gè)硫代磷酸(PS)位點(diǎn)修飾，3’四個(gè)硫代磷酸（PS）位點(diǎn)修飾，全鏈2’-甲基化修飾；

小分子化合物Antagomir-31的序列如下：