[發(fā)明專利]一種基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310279835.0
• 申請(qǐng)日: 2013-07-04
• 公開（公告）號(hào): CN103388024A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘志強(qiáng);曹君利;郝凌云;楊曦;李燕強(qiáng);尹翠;張松;唐倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐州醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于利用芯片進(jìn)行DNA羥甲基化檢測的高通量高靈敏檢測技術(shù)。

背景技術(shù)

5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是新發(fā)現(xiàn)的一種的修飾堿基(KriaucionisandHeintz,2009;Tahilianietal.,2009),以低水平存在于哺乳動(dòng)物的多種細(xì)胞類型中。5hmC是10-11易位(TET)家族的酶通過氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)產(chǎn)生的。5hmC不僅能夠降低MeCP蛋白的甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)與甲基化DNA的親和性,具有潛在的參與基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,而且參與了DNA去甲基化過程，5hmC可能成為某些疾病診斷的新的分子標(biāo)志物。因此關(guān)于5hmC的研究日益受到學(xué)者們的青睞。而5hmC檢測方法的研究則是進(jìn)行5hmC功能分析的前提與重要保證。目前主要有如下檢測方法：一種是基于5hmC敏感酶切方法，另一種是基于抗體識(shí)別5hmC的免疫共沉淀法。前一種方法，已有商品化試劑盒。其基本原理是，首先用β-葡萄糖基化酶處理5hmC,將其特異性地轉(zhuǎn)變成β-葡萄糖基-5羥甲基胞嘧啶(5ghmC)，然后再基于甲基化敏感限制性內(nèi)切酶MspI識(shí)別并切割未修飾胞嘧啶或5mC，5ghmC則不受影響。然后用定量或半定量PCR放大酶切后的基因片段，發(fā)生5hmC可以被擴(kuò)增，未發(fā)生5hmC則不可以被擴(kuò)增。該方法具有較低的成本，但檢測通量有限。后一種方法主要包括5hmC免疫沉淀(5hmCimmunoprecipitation,5hmC-IP)[LiW,LiuM.Distributionof5-hydroxymethylcytosineindifferenthuman?tissues.JNucleicAcids,2011,2011:870726]、抗5-亞甲基磺酸胞嘧啶(antiserumto?cytosine5-methylenesulphonate,anti-CMS)[PastorWA,PapeUJ,HuangY,etal.Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstem?cells.Nature,2011,473(7347):394-7]、結(jié)合蛋白J(J-bindingprotein,JBP)沉淀[Song?CX,SzulwachKE,FuY,etal.Selectivechemicallabelingrevealsthegenome-wide?distributionof5-hydroxymethylcytosine.NatBiotechnol,2011,29(1):68-72]、糖基化、高碘酸氧化和生物素化(glucosylation,periodateoxidation,biotinylation,GLIB)處理等[antiserumtocytosine5-methylenesulphonate,anti-CMS)[PastorWA,PapeUJ,HuangY,etal.Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstemcells.Nature,2011,473(7347):394-7]。這些方法的基本原理是基于抗體能夠識(shí)別5hmC位點(diǎn)，通過抗體對(duì)5hmC的免疫共沉淀，再將沉淀的5hmC片段進(jìn)行克隆后sanger測序或高通量測序。這些檢測方法雖能實(shí)現(xiàn)全基因組的5hmC位點(diǎn)所在片段序列及5hmC分布特征的檢測，但因抗體免疫易出現(xiàn)非特異結(jié)合造成假陽性結(jié)果，難以精確分析特定堿基5hmC的情況以及檢測成本高的缺點(diǎn)。基于以上分析，有必要發(fā)展一種檢測5hmC的高通量、低成本及高特異的方法。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：基于以上原因，本發(fā)明擬提供一種高通量、高特異性、高靈敏度、低成本、操作簡便易行的5hmC位點(diǎn)檢測的有效方法。

本發(fā)明是以如下技術(shù)解決方案實(shí)現(xiàn)的：

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法，首先將不同擴(kuò)增DNA羥甲基化位點(diǎn)的正反向引物固定到芯片或微球；其次，用β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶將DNA上所有5hmC進(jìn)行糖基化，再用MspI酶進(jìn)行酶切，發(fā)生羥甲基化的CCGG不能夠被切開，未發(fā)生羥甲基化的CCGG能夠被切開；然后，再以酶切后基因組DNA為模板與芯片進(jìn)行雜交，并進(jìn)行在片橋式PCR:CCGG位點(diǎn)發(fā)生羥甲基化的因不能被酶切，而能夠進(jìn)行擴(kuò)增；反之，CCGG位點(diǎn)未發(fā)生羥甲基化的因能被酶切，而不能進(jìn)行擴(kuò)增；最后，根據(jù)芯片不同矩陣點(diǎn)熒光的有無，判斷出基因組DNA不同位置的CCGG是否發(fā)生了羥甲基化；