[發明專利]一種基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法

有效

• 申請號: 201310279835.0
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103388024A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 潘志強;曹君利;郝凌云;楊曦;李燕強;尹翠;張松;唐倩
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

1.一種基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法，其特征是：首先將不同擴增DNA羥甲基化位點的正反向引物固定到芯片或微球；其次，用β-葡萄糖基轉移酶將DNA上所有5hmC進行糖基化，再用MspI酶進行酶切，發生羥甲基化的CCGG不能夠被切開，未發生羥甲基化的CCGG能夠被切開；然后，再以酶切后基因組DNA為模板與芯片進行雜交，并進行在片橋式PCR:?CCGG位點發生羥甲基化的因不能被酶切，而能夠進行擴增；反之，CCGG位點未發生羥甲基化的因能被酶切，而不能進行擴增；最后，根據芯片不同矩陣點熒光的有無，判斷出基因組DNA不同位置的CCGG是否發生了羥甲基化；

???其中所述反向引物長為27bp:近5’端7個bp為T,近3’端20bp與每個CCGG位點的CGG后，包括CGG所在序列反向互補；反向擴增引物序列為CCGG被MspI酶切后CGG+的反向互補序列；

正向引物長為20bp,且正向擴增引物序列為待檢測CCGG?位點近5’端的125?bp處一段序列；

相鄰微陣列點間的距離設為80um。

2.根據權利要求1所述的基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法，其特征是：所述的芯片或微球，其表面修飾有丙烯酰胺、醛基或鏈霉親和素修飾。

3.根據權利要求2所述的基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法，其特征是：所述的丙烯酰胺修飾芯片上固定引物的5’端是丙烯酰胺修飾；或醛基修飾芯片上固定引物的5’端為氨基修飾；或鏈霉親和素修飾芯片上固定引物的5’端是生物素修飾。

4.根據權利要求1所述的基于橋式PCR檢測DNA羥甲基化的方法，其特征是：所述的芯片矩陣點熒光，是指在片橋式PCR過程中摻入的熒光dNTP分子，或擴增后產物用SUBGREEN染料染色后生成的熒光。