[發明專利]一種重組人胰島素的制備方法

有效

• 申請號: 201310279340.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103305581A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 譚葉林;肖擁軍;曹春來;陳虹霖
• 申請（專利權）人: 珠海聯邦制藥股份有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

技術領域

本發明屬于胰島素制備領域，特別涉及一種重組人胰島素的制備方法。

背景技術

目前，據國際糖尿病聯盟2011年統計，全球糖尿病患病人數為3.66億，預計2030年將達到5.52億，相當于每十秒鐘增加一名糖尿病患者，或者每年增加一千萬名患者。在我國，糖尿病的患病率在近10年翻了近兩倍。2010年，我國成人糖尿病的患病率為9.7%，患者總數已超過9000萬，成為世界第一糖尿病大國;同時，糖尿病前期的糖耐量受損人群達到了1億4千8百萬人，患病率為15.5%。所以用胰島素治療糖尿病市場巨大。

目前臨床應用中，胰島素是降低體內血糖最有效的藥物，一型糖尿病患者和嚴重的二型糖尿病患者都必須注射胰島素，補充胰島素以控制血糖的水平，提高患者的生活質量的同時降低糖尿病并發癥的發生。我國胰島素的市場95%的由國外廠商壟斷，價格比較昂貴，嚴重影響到我國糖尿病用藥的安全；同時由于國外公司把持我國胰島素市場，導致胰島素在我國糖尿病患者的使用率較低。為了打破國外廠商對于我國胰島素市場的壟斷，提高國產重組人胰島素的競爭優勢，勢必需要對現有的重組人胰島素生產工藝進行革新，以降低生產成本。

目前重組人胰島素及其類似物的生產采用了兩套系統，其一是用酵母系統（CN1414974A；CN1873006A；CN1125081C）；其二是用大腸桿菌系統（CN1163600C；CN1011073006A）。酵母系統采用了分泌人胰島素原類似物的方式，分泌出來的人胰島素前體已具有了天然的二硫鍵及正確的N-端。缺點在于酵母菌生長慢，導致生產周期長，且表達水平很低。應用大腸桿菌表達重組人胰島素生產的方式主要包括三種方式：一種是美國禮來公司1982年采用的重組大腸桿菌分別表達胰島素的A鏈和B鏈，表達產物經溴化氰（bromine?cyanide,CNBr）切下融合導肽片段后，得到的A鏈和B鏈經純化后再進行復性，最后得到有活性的重組人胰島素。由于該方式的復性率只有10%左右，采用這條工藝生產的胰島素成本太高。第二種也是美國禮來公司建立的，目前仍然是諸多公司生產重組人胰島素的主要方式。由于正常序列的人胰島素原（B-C-A）在大腸桿菌中不穩定而容易降解，通常采用融合蛋白的形式，將人胰島素原接在一個較大的N-端融合蛋白后面，大大增加了胰島素原的表達量（10%-30%）（Castellanos-Serra,et?al.1996;Tikhonov,et?al.2001），表達產物通過溴化氰釋放出人胰島素原。由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構象，折疊率達到70%，從而在一定程度上降低了胰島素的生產成本。第三種方式是丹麥諾和諾德公司采用的A、B鏈同時表達的方法，在A鏈前端和A、B鏈中間均有甲硫氨酸。表達產物經溴化氰處理，得到A鏈和B鏈，再經過復性和純化得到有活性的重組人胰島素，這種方式與第一種方式存在著同樣的因為復性效率帶來的成本問題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）是目前進行胰島素前體表達來進行胰島素生產的熱點，也是近十年來受到廣大研究者的青睞。主要原因是：一、該表達系統同時兼有原核表達系統和真核表達系統的優點；二、培養操作容易，生長速度快，表達量高，產物不會過度糖基化，蛋白抗原性低。

雖然，用畢赤酵母表達生產重組人胰島素前體量高，但是最重要的步驟是轉肽，該步驟最為明顯的是成本高、收率低、時間長，要想產品有競爭力，降低成本、提高收率將是我們轉肽重點。

在已經報道的文獻中，轉肽反應都是在少水的有機相中一步進行完成的。常用的有機溶劑：DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、DMA（N、N-二甲基乙酰胺）、DMSO（二甲基亞砜）、1,4-丁二醇、THF（四氫呋喃）或二氧六環等。為了提高收率減少轉肽反應時間，叔丁醚蘇氨酸叔丁酯與重組人胰島素前體的摩爾比達到近100：1甚至更高。而胰蛋白酶與重組人胰島素前體的質量比也將近1：5，雖然加的酶量很高，但是轉肽反應時間一般都要10小時以上，也是因為反應時間長反應生產出來的雜質也很多，這樣對后序純化帶來了麻煩和壓力，同時使整個下游工序成本升高，收率降低。

在國家發明專利申請CN102703552A中披露了采用兩步法代替一步法的胰島素生產工藝的具有提高的轉化效率，降低整個生產工藝的成本。但是工藝開發過程中，采用了兩次凍干的工藝，不適合工業的放大和成本的降低，另外轉肽反應中胰島素的濃度比較低，為2.5～10mM。在專利CN100424179C中也提到了采用先酶切后轉肽的思路，其酶切后的產物不需要分離，其具有技術上的優勢，但是從酶切體系轉換成轉肽體系中，需要添加入大量的有機化合物，同時也降低了轉肽反應的胰島素濃度（約5mM）。