[發明專利]一種重組人胰島素的制備方法

有效

• 申請號: 201310279340.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103305581A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 譚葉林;肖擁軍;曹春來;陳虹霖
• 申請（專利權）人: 珠海聯邦制藥股份有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

1.一種重組人胰島素的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）在有機溶劑與水的混合溶液中對重組人胰島素前體進行酶切反應，得到含有desB₃₀人胰島素溶液；

（2）從含有desB₃₀人胰島素的溶液，離心或抽濾得到desB₃₀人胰島素含水粉末；

（3）使用desB₃₀人胰島素含水粉末進行轉肽反應，得到人胰島素酯；其中，desB₃₀人胰島素在轉肽反應體系中的終濃度為12.1mM～33mM；

（4）將重組人胰島素酯脫酯，即得重組人胰島素。

2.根據權利要求1所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的有機溶劑的濃度為體積百分比0.1～30%；

所述的有機溶劑為異丙醇或乙醇。

3.根據權利要求1所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：步驟（1）為：在有機溶劑與水的混合溶液中對重組人胰島素前體進行酶切反應，酶切的條件為將pH值調節為7～9，于20～30℃反應，得到含有人胰島素B鏈第30位缺少蘇氨酸的人胰島素溶液；其中，胰蛋白酶與重組人胰島素前體按質量比1：50～500配比。

4.根據權利要求3所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的反應的時間為1～8小時；

步驟（1）中所述的pH值用氨水調節；

所述的胰蛋白酶與所述的重組人胰島素前體按質量比1：300配比。

5.根據權利要求1所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：步驟（2）中所述的離心或抽濾之前，先對含有desB₃₀人胰島素的溶液進行沉淀。

6.根據權利要求5所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：所述的對含有desB₃₀人胰島素的溶液進行沉淀的方式為調節pH值之后靜置沉淀，或是先加入Zn²⁺，再調節pH值，之后靜置沉淀。

7.根據權利要求6所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：所述的pH值為5.6～6；

所述的調節pH值的試劑可以為磷酸、醋酸和氨水中一種或至少兩種；

所述的Zn²⁺的用量按desB₃₀人胰島素與Zn²⁺的摩爾比為1：0.5～1.5進行計算添加；

所述的靜置的溫度為4～8℃。

8.根據權利要求1所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：

步驟（3）中所述的轉肽反應包括如下步驟：用二甲基亞砜溶解蘇氨酸或其衍生物，以及desB₃₀人胰島素含水粉末，再加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液或是只加入胰蛋白酶水溶液，獲得轉肽的反應體系；然后攪拌進行反應；

desB₃₀人胰島素與蘇氨酸酯或其衍生物的摩爾比為1：15～150，desB₃₀人胰島素與胰蛋白酶按質量比為10～80：1。

9.根據權利要求8所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：

所述的蘇氨酸酯為o-叔丁基醚-l-蘇氨酸叔丁酯；

所述的衍生物指的是o-叔丁基醚-l-蘇氨酸叔丁酯鹽類衍生物；

所述的反應體系中溶劑的比例為二甲基亞砜：1,4-丁二醇：水按體積比15%～50%：0～65%：20%～50%；其中水的含量中包含了desB₃₀人胰島素含水粉末中包含的水分。

10.根據權利要求1所述的重組人胰島素的制備方法，其特征在于：步驟（4）中所述的脫酯為采用三氟乙酸試劑進行脫酯。