[發(fā)明專利]一種水稻基因組定點改造方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310278482.2 | 申請日： | 2013-07-04 |
| 公開（公告）號： | CN103382468A | 公開（公告）日： | 2013-11-06 |
| 發(fā)明（設計）人： | 高彩霞;單奇?zhèn)?/a>;王延鵬;李君;陳坤玲 | 申請（專利權）人： | 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 |
| 主分類號： | C12N15/09 | 分類號： | C12N15/09;C12N15/63 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 水稻 基因組 定點 改造 方法 | ||
技術領域
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及一種水稻基因改造方法。?
背景技術
水稻是世界上最重要且廣泛種植的農(nóng)作物之一，對水稻基因組的改造有利于提高產(chǎn)量，增強其對病蟲害的抗性和逆境抵御能力，對農(nóng)業(yè)發(fā)展有重要意義。目前的基因組工程（Genome?engineering）技術中，主要通過鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應因子核酸酶（TALENs）來做基因改造。但是將這些技術用于水稻基因定點改造，操作過程復雜，成本較高，技術難度較大，因此，亟待開發(fā)更加高效、廉價并且簡單的水稻基因改造新技術。?
最近發(fā)現(xiàn)的原核生物的第二類適應性免疫系統(tǒng)CRISPR（成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列）提供了另一個基因組工程的方法。第二類CRISPR系統(tǒng)廣泛存在于細菌中，它們利用一個核酸內(nèi)切酶Cas9為它們自身提供了防御病毒和質(zhì)粒入侵的手段。Cas9可以和一個人工合成的向?qū)NA（guide?RNA，gRNA）組成復合體，向?qū)NA由crRNA（CIRSPR?RNA）和tracr?RNA（trans-activating?crRNA）融合產(chǎn)生。由gRNA引導Cas9核酸內(nèi)切酶識別并切斷靶位點DNA序列。Cas9有兩個關鍵的結(jié)構域：HNH和RuvC，它們分別切開DNA雙鏈中的一條單鏈。產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），細胞啟動修復機制，通過非同源末端連接（NHEJ）這種不精確的修復方式可以產(chǎn)生基因定點突變，通過同源重組（HR）方式修復可以實現(xiàn)精確的基因定點插入或基因替換。該系統(tǒng)已經(jīng)在細菌、人類細胞、斑馬魚和小鼠中成功進行基因組工程研究。?
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻基因組定點改造方法。?
本發(fā)明的一個目的是提供一種實現(xiàn)水稻目的基因中靶標片段上的隨機插入和/或隨機缺失的基因改造方法。?
本發(fā)明所述的實現(xiàn)水稻目的基因中靶標片段上的隨機插入和/或隨機缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系統(tǒng)在水稻中對目的基因進行改造，該系統(tǒng)包括向?qū)NA和Cas9核酸酶，可包含以下步驟：使水稻組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶，然后在向?qū)NA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標片段被剪切，再通過水稻細胞的自身DNA修復功能，最終實現(xiàn)水稻目的基因中靶標片段上的隨機插入和/或隨機缺失；?
所述靶標片段位于所述目的基因上；所述雙鏈靶標片段中的一條鏈具有如下結(jié)構：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30；?
所述向?qū)NA依次由能夠與所述靶標片段互補結(jié)合的RNA片段和骨架RNA片段連接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成類似發(fā)夾結(jié)構的RNA,所述骨架RNA片段可與Cas9核酸酶結(jié)合。?
本發(fā)明的另一個目的是提供一種實現(xiàn)水稻目的基因中靶標片段中定點插入已知序列DNA的基因改造方法。?
本發(fā)明所提供的實現(xiàn)水稻目的基因中靶標片段中定點插入已知序列DNA的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系統(tǒng)在水稻中對目的基因進行改造，該系統(tǒng)包括向?qū)NA和Cas9核酸酶，該方法可包含以下步驟：使水稻組織中含有向?qū)NA、Cas9核酸酶和單鏈寡核苷酸DNA，然后在向?qū)NA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標片段被剪切，再通過同源重組，最終實現(xiàn)水稻目的基因的靶標片段中插入已知序列DNA；?
所述靶標片段位于所述目的基因上；所述雙鏈靶標片段中的一條鏈具有如下結(jié)構：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30；?
所述向?qū)NA依次由能夠與所述靶標片段互補結(jié)合的RNA片段和骨架RNA片段連接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成類似發(fā)夾結(jié)構的RNA,所述骨架RNA片段可與Cas9核酸酶結(jié)合。?
所述單鏈寡核苷酸DNA依次由同源臂A、所述已知序列DNA、同源臂B連接而成；同源臂A的序列與目的基因上靶標片段的上游序列相同，同源臂B的序列與目的基因上靶標片段的下游序列相同。?
具體的，所述同源臂A和所述同源臂B的長度各為30bp。?
所述方法中，所述5’-NX-NGG-3’中，19≤X≤21，具體X為20。?
所述方法中，所述向?qū)NA中能夠與所述靶標片段互補結(jié)合的RNA片段為能與所述5’-NX-NGG-3’中NX片段互補結(jié)合的RNA片段。?
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