[發明專利]一種水稻基因組定點改造方法

有效

• 申請號: 201310278482.2
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103382468A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 高彩霞;單奇偉;王延鵬;李君;陳坤玲
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種實現水稻目的基因中靶標片段上的隨機插入和/或隨機缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系統在水稻中對目的基因進行改造，該系統包括向導RNA和Cas9核酸酶，其特征在于：所述方法包含以下步驟：使水稻組織中含有向導RNA和Cas9核酸酶，然后在向導RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標片段被剪切，再通過水稻細胞的自身DNA修復功能，最終實現水稻目的基因中靶標片段上的隨機插入和/或隨機缺失；

所述靶標片段位于所述目的基因上；所述雙鏈靶標片段中的一條鏈具有如下結構：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30；

所述向導RNA依次由能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段和骨架RNA片段連接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成類似發夾結構的RNA,所述骨架RNA片段可與Cas9核酸酶結合。

2.一種實現水稻目的基因中靶標片段中定點插入已知序列DNA的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系統在水稻中對目的基因進行改造，該系統包括向導RNA和Cas9核酸酶，其特征在于：所述方法包含以下步驟：使水稻組織中含有向導RNA、Cas9核酸酶和單鏈寡核苷酸DNA，然后在向導RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標片段被剪切，再通過同源重組，最終實現水稻目的基因的靶標片段中插入已知序列DNA；

所述靶標片段位于所述目的基因上；所述雙鏈靶標片段中的一條鏈具有如下結構：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30；

所述向導RNA依次由能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段和骨架RNA片段連接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成類似發夾結構的RNA,所述骨架RNA片段可與Cas9核酸酶結合；

所述單鏈寡核苷酸DNA依次由同源臂A、所述已知序列DNA、同源臂B連接而成；同源臂A的序列與目的基因上靶標片段的上游序列相同，同源臂B的序列與目的基因上靶標片段的下游序列相同。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述5’-N_X-NGG-3’中，19≤X≤21，具體X為20。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述向導RNA中能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段為能與所述5’-N_X-NGG-3’中NX片段互補結合的RNA片段。

5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述向導RNA中骨架RNA片段是由SEQ?ID?No.3中第411-493位核苷酸所示DNA轉錄出來的RNA。

6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述使水稻組織中含有向導RNA和Cas9核酸酶的方法為：向水稻組織中直接轉入所述向導RNA和帶有核定位信號肽的Cas9核酸酶。

7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述使水稻組織中含有向導RNA和Cas9核酸酶的方法為：向水稻組織中導入含有所述向導RNA的表達盒的重組克隆載體和含有所述帶有核定位信號肽的Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達載體，所述向導RNA的表達盒在水稻組織中表達出向導RNA，所述帶有核定位信號肽的Cas9核酸酶的編碼基因在水稻組織中表達出帶有核定位信號肽的Cas9核酸酶。

8.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述向導RNA的表達盒由U3啟動子和所述向導RNA的編碼基因組成；所述向導RNA的編碼基因由所述能與所述靶標序列互補結合的RNA片段的編碼基因和所述骨架RNA片段的編碼基因組成。

9.根據權利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述向導RNA的表達盒中啟動子為U3啟動子時，所述靶標片段的一條鏈具有如下結構：5’A-N_X-NGG-3’，N及X與權利要求1或2中定義相同。

10.根據權利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述帶有核定位信號肽的Cas9核酸酶的編碼基因中，所述Cas9核酸酶的編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1中第37-4161位核苷酸所示。