[發明專利]一種B族鏈球菌熒光PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310275655.5
• 申請日: 2013-07-02
• 公開（公告）號: CN103409509A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 李榮宇;劉中華;王國強;白楊;張旭
• 申請（專利權）人: 江蘇碩世生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;G01N21/64
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;韓小雷

技術領域

本發明涉及一種熒光PCR檢測試劑盒，具體涉及一種B族鏈球菌熒光PCR檢測試劑盒，屬于生物技術領域。

背景技術

B族鏈球菌(group?B?streptococcus,GBS)是一種寄生于人類泌尿生殖道及下消化道的條件致病菌，健康人群帶菌率可達35%。早在20世紀70年代GBS就已經被證實為圍產期母嬰感染的重要致病菌之一。定植于產婦生殖道的B族鏈球菌，可在分娩時垂直傳播給新生兒，而新生兒GBS感染所引起的新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎等癥致死率極高，并可導致神經系統后遺癥。2010年美國疾病預防中心制定了《圍產期GBS預防指南》，建議孕婦于妊娠35-37周進行GBS篩查。

目前國內對GBS的篩查以培養法為主，檢測GBS的金標準為：孕35-37周取陰道及直腸標本，于肉湯培養基培養呈陽性。傳統培養法耗時長，且陽性率受到多種因素影響，弊端明顯。相比細菌培養法，熒光PCR法檢測不僅耗時短，在靈敏度和特異性上也優于培養法，因此研制出一種使用簡單、結果準確的B族鏈球菌PCR檢測試劑具有重要的臨床意義。

B族鏈球菌的檢測方法主要有細菌培養法，免疫學診斷和分子生物學診斷。細菌培養法是B族鏈球菌的實驗室診斷常規方法，分子生物學診斷中出現了許多快速特異的方法，三種方法具有以下特點：

1）細菌培養法是當前B族鏈球菌檢測的金標準。該方法成本低廉，受人為因素影響較大，并且培養所需耗時較長，不適合當前的臨床診斷。

2）血清學方法不能高通量處理樣本。由于窗口期的存在，血清學的診斷存在滯后性，不能準確反映當前是否感染。該方法費時、費力，無法滿足快速、早期診斷的要求。

3）細菌核酸檢測：由于以上兩種方法費時、費力，為了提高檢測速度，可直接從臨床標本（陰道拭子、肛拭子）中檢測細菌的核酸。該方法具有快速性、準確性和高靈敏性等優點，能夠對細菌感染作出早期診斷，給疫情的快速分析和控制提供有力的技術支撐。其中的實時定量PCR檢測平臺已成為最簡捷和可靠的細菌檢測方法。

由此可見，作為金標準的細菌培養法比較費時，血清學診斷方法存在滯后性。此外，基因序列測定方法也較為復雜和繁瑣的。

發明內容

為了克服以上不足，本發明提供了一種B族鏈球菌熒光PCR檢測試劑盒。

一種B族鏈球菌熒光PCR檢測試劑盒，包括以下各組分：包括PCR反應液、酶混合液、B族鏈球菌反應液、內參質粒、陽性對照和陰性對照。

其中，所述的B族鏈球菌反應液包括以下組分：

組分（1）：由一對檢測B族鏈球菌的引物和一條檢測B組鏈球菌的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示；探針的堿基序列為SEQ?ID?No.3所示，該探針的5′端標記有熒光報告基團，3′端標記有熒光淬滅基團；

組分（2）：由一對檢測人TOP3A基因片段的引物和一條檢測人TOP3A基因片段的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.5所示；探針的堿基序列為SEQ?ID?No.6所示，該探針的5′端標記有熒光報告基團，3′端標記有熒光淬滅基團。

其中，所述的熒光報告基團選自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas?Red和LC?RED640中任意兩種熒光報告基團，且組分（1）和組分（2）中的熒光報告基團不同；所述的熒光淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1和Tamra等任意兩種熒光淬滅基團。

本發明對上述引物和探針的配比比例進行了摸索和優化，試驗結果發現，它們之間不同的配比比例對于檢測結果的特異性和靈敏性具有顯著的差異，本發明通過高通量的篩選試驗發現，上述引物和探針在下述配比下，具有最優的檢測效果：

檢測B族鏈球菌的引物及探針的配比為：SEQ?ID?No.1:SEQ?ID?No.2:SEQ?ID?No.3為5:5:2；優選的，引物SEQ?ID?No.1為500nM，SEQ?ID?No.2為500nM，探針SEQ?ID?No.3為200nM。

檢測人TOP3A基因片段的引物及探針的配比為：SEQ?ID?No.4:SEQ?ID?No.5:SEQ?ID?No.6為5:5:2；優選的，引物SEQ?ID?No.1為500nM，SEQ?ID?No.2為500nM，探針SEQ?ID?No.3為200nM。

B族鏈球菌/人TOP3A引物探針核苷酸序列見表1：