[發(fā)明專利]一種利用氧載體促進(jìn)畢赤酵母高密度發(fā)酵的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310271420.9
• 申請(qǐng)日: 2013-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN103333921A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張玲華;明飛平;鄺哲師;夏楓耿;葉明強(qiáng);趙祥杰;楊軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P1/02
• 分類號(hào): C12P1/02;C12R1/84
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物的高密度發(fā)酵方法，具體涉及一種利用氧載體促進(jìn)畢赤酵母高密度發(fā)酵的方法。

背景技術(shù)

畢赤酵母（pichia?pastoris）是近年發(fā)展起來(lái)的一種以甲醇為碳源的真核表達(dá)系統(tǒng)，?酵母可對(duì)異源蛋白進(jìn)行修飾，采用有信號(hào)肽的質(zhì)粒時(shí)，蛋白能被正確折疊和加工，然后分泌到培養(yǎng)基中。具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白的許多相似優(yōu)點(diǎn)外，還具有操作簡(jiǎn)便，營(yíng)養(yǎng)要求低，培養(yǎng)價(jià)格低廉，便于高密度發(fā)酵，高產(chǎn)量分泌表達(dá)外源蛋白以及表達(dá)產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)己成功用于多種蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。

但在畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中，由于其對(duì)氧氣的需求非常大，只靠普通的通氣供氧，往往不能滿足畢赤酵母的生長(zhǎng)要求，而成為制約畢赤酵母高密度發(fā)酵的一個(gè)瓶頸。

氧載體(Oxygen-vectors)?是一種與水不互溶，對(duì)微生物無(wú)毒，具有較高溶氧能力的有機(jī)體。它與發(fā)酵液形成的體系具有氧傳遞速度快、能耗低、氣泡生成少、剪切力小等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有畢赤酵母高密度發(fā)酵過(guò)程中氧氣供給技術(shù)難以攻克的缺陷，提供一種利用氧載體促進(jìn)畢赤酵母高密度發(fā)酵的方法，所述方法簡(jiǎn)單易行，基于所述方法，可成功實(shí)現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

????一種利用氧載體促進(jìn)畢赤酵母高密度發(fā)酵的方法，包括如下步驟：

S1.將畢赤酵母菌株復(fù)活和擴(kuò)大培養(yǎng)得到發(fā)酵菌種；

S2.向發(fā)酵菌種中添加甘油，保存?zhèn)溆茫?/p>

S3.將S2所述添加了甘油的發(fā)酵菌種以1.0～1.2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液，按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)，分別在培養(yǎng)0～3h、24～27h、72～75h、96～98?h時(shí)向發(fā)酵液中添加分別占發(fā)酵液0.5～1%正已烷，0.5～1%正十二烷，0.08～0.2%?吐溫-80和0.1～0.5%豆油；培養(yǎng)72～75小時(shí)后，加入甲醇進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)直至發(fā)酵培養(yǎng)6~8天終止發(fā)酵。

???優(yōu)選地，分別在培養(yǎng)2～3h、26～27h、74～75h、97～98?h時(shí)向發(fā)酵液中添加分別占發(fā)酵液0.8～1%正已烷，0.8～1%正十二烷，0.15～0.2%?吐溫-80和0.3～0.5%豆油，更優(yōu)選地，分別在培養(yǎng)2h、26h、74h、97?h時(shí)向發(fā)酵液中添加分別占發(fā)酵液0.8%正已烷，0.8%正十二烷，0.15%?吐溫-80和0.3%豆油。

本發(fā)明所述正已烷、正十二烷、吐溫-80和豆油都屬于有效的氧載體，本發(fā)明利用氧載體，大幅度提高畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)體系中的氧氣含量，以滿足畢赤酵母的生長(zhǎng)，并大幅度提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，同時(shí)由于氧載體能減少氣泡的產(chǎn)生，從而減少消泡劑的使用量。而大量使用消泡劑對(duì)發(fā)酵菌種是有害的，且產(chǎn)物不易純化。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY液體培養(yǎng)基：蛋白胨2～2.5g，酵母提取物1～1.5g，加入去離子水70～75ml，121～123℃，20～25min高壓滅菌，而后加入無(wú)菌的10～10.5×GY，10～10.5×YNB，10～10.5×磷酸鹽緩沖液各10～10.5ml，冷至室溫后補(bǔ)加200～205微升500～505×Biotin即配成BMGY培養(yǎng)基。

微量鹽溶液：硫酸銅6.0～6.5克，碘化鈉0.08～0.1克，硫酸錳3.0～3.5克，鉬酸鈉0.2～0.25克，硼酸0.02～0.025克，氯化鉆0.5～0.55克，氯化鋅20.0～20.5克，硫酸亞鐵65.0～65.5克，生物素0.2～0.25克，硫酸5.0～5.5ml，加去離子水至1～1.1?L，過(guò)濾滅菌后室溫儲(chǔ)存。

優(yōu)選地，步驟S2所述甘油的添加量按照發(fā)酵菌種體積量的12～15%確定，更優(yōu)選地，步驟S2所述甘油的添加量按照發(fā)酵菌種體積量的12～15%確定，

優(yōu)選地，步驟S3所述甲醇的添加方式為以流加方式添加含10～12ml/L?微量鹽溶液的甲醇，起始添加濃度為0.1～0.3%/h；隨著酵母對(duì)甲醇碳源的適應(yīng)性利用和菌數(shù)生長(zhǎng)的增加，逐漸以0.3～0.5%/h、0.5～0.7%/h、0.7～0.9%/h梯度提高甲醇流加速率，至終濃度為1～2%/h。

優(yōu)選地，步驟S3所述發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，攪拌轉(zhuǎn)速為300～320rpm，通風(fēng)量為1：0.8～1vvm，控制DO在40～80%。

優(yōu)選地，步驟S1所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115、畢赤酵母KM71或畢赤酵母SMD1168。

優(yōu)選地，步驟S1所述畢赤酵母菌株復(fù)活和擴(kuò)大培養(yǎng)得到發(fā)酵菌種的具體步驟為：