[發(fā)明專利]4H?[1]?苯并吡喃[4,3?b]噻吩?2?甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光檢測中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310268939.1
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN104251849B
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金利泰;叢維濤;朱忠欣;洪國贏
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州安得森生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糖蛋白特異性熒光檢測技術(shù)，具體地說是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)糖基化修飾在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用，作為最主要和普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動物蛋白質(zhì)中至少有二分之一發(fā)生了糖基化，這些糖蛋白廣泛分布于組織、細(xì)胞、體液中，特別是在細(xì)胞膜表面、體液等中含量豐富，糖基化對于蛋白質(zhì)的折疊、運輸和定位等都起著重要作用，并參與受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞載附等諸多重要的生物過程。糖蛋白數(shù)量變化或糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。不但目前已知的很多疾病的診斷標(biāo)志物是糖蛋白，而且通過國際標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的藥物中，糖蛋白也占到較高的比例。

目前糖蛋白檢測領(lǐng)域試劑盒主要集中于外國的生物試劑公司，且多數(shù)產(chǎn)品均以高附加值的價格在市場銷售，價格高昂，不利于生物技術(shù)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。尤其國內(nèi)利用現(xiàn)有的生物試劑進(jìn)行生物實驗成本居高不下，無法實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與實驗共同發(fā)展。本發(fā)明開發(fā)的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物熒光染色方法靈敏度接近Pro-Q Emerald488染色法，是一種靈敏、便捷、特異的糖蛋白熒光檢測技術(shù)，有較好的基礎(chǔ)與臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性熒光檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼相關(guān)化合物是指以4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼陰離子為母核的鈉鹽、鉀鹽和銨鹽等。

4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核為：

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了應(yīng)用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼進(jìn) 行糖蛋白特異性熒光檢測的方法包括如下步驟：

1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后含蛋白質(zhì)樣品的凝膠置于固定液中固定10～60min，棄固定液。優(yōu)選的固定時間為30min，固定液可以是含有40％乙醇和10％乙酸的水溶液；

2)在高碘酸溶液里氧化10～40min，其中高碘酸溶液為含重量體積比0.1～1％的高碘酸及按體積比0.5～5％的乙酸水溶液。然后用按體積比0.5～5％的乙酸水溶液沖洗2～5次，每次1～10min；優(yōu)選的氧化時間為20min，優(yōu)選的氧化液組成為含重量體積比0.5％的高碘酸及按體積比1％的乙酸水溶液；

3)加入染色液1～40min，其中染色液為含重量體積比0.0001～0.001％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物及按體積比0.5～5％的乙酸水溶液。優(yōu)選的染色時間為10min，優(yōu)選的染色液組成為含重量體積比0.0002％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及按體積比1％的乙酸水溶液；

4)加入洗脫液，洗脫液組成為體積比0.5～5.0％的乙酸，10～70％乙醇及0.5～2％乙醇胺水溶液，洗脫1～3次，每次1～10min。優(yōu)選的洗脫時間為20min，優(yōu)選的洗脫液組成為按體積比1.0％乙酸，40％乙醇及1％乙醇胺水溶液；

5)檢測，可在激光掃描儀下觀察染色后的糖蛋白。

前期研究表明該技術(shù)有如下優(yōu)點：

1)靈敏度高：4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特異性熒光檢測法靈敏度同Pro-Q Emerald488靈敏度相當(dāng)；

2)操作簡單迅速：操作步驟少，可在2個小時內(nèi)完成；

3)重現(xiàn)性好：受溫度、搖床擺動頻率等外部條件影響較小；

4)可逆性好：容易脫色；

5)質(zhì)譜兼容性好：由于4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼熒光檢測法不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所以可與MALDI-TOF等質(zhì)譜儀高度兼容；

6)使用安全：采用毒性低的染料，提高實驗操作的安全性，對環(huán)境污染小；

7)成本低。

附圖說明

圖1.4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化學(xué)結(jié)構(gòu)；