[發明專利]pGreen Max1真核表達載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310268113.5
• 申請日: 2011-04-20
• 公開（公告）號: CN103305546A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 李大偉;徐維果;武正華;金龍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

本發明是由專利申請號為：201110099371.6，專利申請名稱為：“pGreen?Max1真核表達載體及其制備方法”，專利申請人為：上海交通大學，專利申請日為：2011年4月20日的專利分案申請。

技術領域

本發明涉及的是一種分子生物技術領域的載體及其制備方法，特別涉及的是一種pGreen?Max1真核表達載體及其制備方法。

背景技術

真核表達載體主要用于在細胞內大量表達某些特定的蛋白，目前已有的真核表達載體主要有：

（1）pCMVp-NEO-BAN載體，該載體在大多數真核細胞中都可以高水平穩定地表達外源目的基因，并可以利用G418進行篩選。

（2）pEGFP載體，如U.S.Patent?Nos.5625048issued?on?April29,1997。pEGFP載體的特點是可以表達綠熒光蛋白，通過固定波長的光波激發可以發出綠熒光，該載體可以表達一個蛋白，使之與綠熒光形成融合蛋白，用于確定外源基因在細胞中的定位，同時，該載體可以用G418來篩選。

上述載體都有不足之處，pCMVp-NEO-BAN載體可以很好的表達外援蛋白，但篩選克隆和鑒定蛋白的表達量比較困難，不利于篩選。pEGFP載體可以比較簡單的用于篩選和檢測蛋白的表達量，但是由于要與綠熒光蛋白融合形成融合蛋白，對目的蛋白構象、后續加工和分布會有影響。pGreen?Max1載體很好的解決了這幾個問題。它可以通過G418先進行初步的篩選克隆，然后可以根據細胞綠熒光的表達量來判斷穩定細胞株的目的蛋白的表達量，并且綠熒光蛋白和目的蛋白不是形成融合蛋白，而是分別形成兩個蛋白，對于目的蛋白構象和后續加工完全沒有影響。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種pGreen?Max1真核表達載體及其制備方法，本發明可在哺乳動物細胞內高效表達蛋白或抗體，實現高產細胞株篩選提供穩定篩選標記。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明涉及的pGreen?Max1真核表達載體，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達載體重組獲得序列1，序列1共計7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。

本發明涉及的上述pGreen?Max1真核表達載體的制備方法，通過設計引物從質粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，并將PCR產物經過SmaI位點定向插入到pMex真核載體，并經過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構建重組的pGreen?Max真核表達載體。

所述的pGreen?Max1真核表達載體的制備方法，包括如下步驟：

A、設計引物：根據Mex序列設計引物，上游引物加入PmeI位點，引物序列如下：

Mex?F：GATATCGTTT?AAACGCTCTT?CCTGCATCAC?GGGAGAT

Mex?R：TGAGGCCTGA?GTTCAGACCG?GT

B、目的片段的克隆：以帶有Mex的質粒為模板，進行PCR擴增：模板1μl，上下游引物10μM各1μl，2.5mM的dNTP底物4μl，10倍緩沖液5μl，pfu聚合酶1μl，雙蒸水37μl；95℃變性2分鐘；然后94℃變性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸50秒，進行30-40個循環；最后72℃延伸7-10分鐘；

C、擴增產物純化：PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，可見一條約647bp的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel?Extraction?Kit?DNA純化試劑盒進行純化；

D、pMex真核載體的構建：

D-1、酶切：將載體用SmaI酶進行酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩沖液2μl，SmaI1μl，載體5μl，無離子水12μl，37℃水浴4個小時，酶切后的載體片段經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；

D-2、連接：回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應；

D-3、轉化大腸桿菌：將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐霉素100μl/ml的LB培養基上37℃培養12-16小時；

D-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆：將菌落放大培養，純化提取質粒；

D-5、利用SpeI進行酶切鑒定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒；