[發(fā)明專利]pGreen Max1真核表達(dá)載體及其制備方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201310268113.5 | 申請(qǐng)日： | 2011-04-20 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN103305546A | 公開（公告）日： | 2013-09-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李大偉;徐維果;武正華;金龍 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/79 | 分類號(hào)： | C12N15/79;C12N15/66;C12N15/85 |
| 代理公司： | 上海交達(dá)專利事務(wù)所 31201 | 代理人： | 王毓理;王錫麟 |
| 地址： | 200240 *** | 國(guó)省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | pgreen max1 表達(dá) 載體 及其 制備 方法 | ||
1.一種pGreen?Max1真核表達(dá)載體，其特征在于，所述載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達(dá)載體重組獲得序列1，序列1共計(jì)7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的pGreen?Max1真核表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，通過(guò)設(shè)計(jì)引物從質(zhì)粒中通過(guò)PCR的方法克隆得到Mex，并將PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)SmaI位點(diǎn)定向插入到pMex真核載體，并經(jīng)過(guò)BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構(gòu)建重組的pGreen?Max真核表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該方法具體包括如下步驟：
A、設(shè)計(jì)引物：根據(jù)Mex序列設(shè)計(jì)引物，上游引物加入PmeI位點(diǎn)，引物序列如下：
Mex?F：GATATCGTTT?AAACGCTCTT?CCTGCATCAC?GGGAGAT
Mex?R：TGAGGCCTGA?GTTCAGACCG?GT
B、目的片段的克隆：以帶有Mex的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：模板1μL，上下游引物10μM各1μL，2.5mM的dNTP底物4μL，10倍緩沖液5μL，pfu聚合酶1μL，雙蒸水37μL；95℃變性2分鐘；然后94℃變性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸50秒，進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7-10分鐘；
C、擴(kuò)增產(chǎn)物純化：PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，將一條約647bp的擴(kuò)增目的條帶切下，用Gel?Extraction?Kit?DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；
D、pMex真核載體的構(gòu)建：
D-1、酶切：將載體用SmaI酶進(jìn)行酶切，酶切時(shí)在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液2μL，SmaI1μL，載體5μL，無(wú)離子水12μL，37℃水浴4個(gè)小時(shí)，酶切后的載體片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；
D-2、連接：回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)；
D-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌：將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素100μL/mL的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)；
D-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆：將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒；
D-5、利用SpeI進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pMex真核表達(dá)質(zhì)粒；
E、得到IRES-EGFP序列：在質(zhì)粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，并經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，將一條約1300bp的目的條帶切下，用Gel?Extraction?Kit?DNA純化試劑盒進(jìn)行純化；
F、pGreen?Max1真核表達(dá)載體的構(gòu)建：
F-1、酶切：將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切時(shí)在反應(yīng)體系中加入10倍緩沖液2μL，BamHI1μL，NotIμL，pMex載體5μL，無(wú)離子水12μL，37℃水浴4個(gè)小時(shí)，酶切后的載體片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；
F-2、連接：回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進(jìn)行體外連接反應(yīng)；
F-3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌：將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐霉素100μL/mL的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)；
F-4、篩選重組真核表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆：將菌落放大培養(yǎng)，純化提取質(zhì)粒；
F-5、利用HindIII進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)得到序列1的pGreen?Max1真核表達(dá)質(zhì)粒。
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