[發明專利]pGreen Max1真核表達載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310268113.5
• 申請日: 2011-04-20
• 公開（公告）號: CN103305546A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 李大偉;徐維果;武正華;金龍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種pGreen?Max1真核表達載體，其特征在于，所述載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達載體重組獲得序列1，序列1共計7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。

2.一種根據權利要求1所述的pGreen?Max1真核表達載體的制備方法，其特征在于，通過設計引物從質粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，并將PCR產物經過SmaI位點定向插入到pMex真核載體，并經過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構建重組的pGreen?Max真核表達載體。

3.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，該方法具體包括如下步驟：

A、設計引物：根據Mex序列設計引物，上游引物加入PmeI位點，引物序列如下：

Mex?F：GATATCGTTT?AAACGCTCTT?CCTGCATCAC?GGGAGAT

Mex?R：TGAGGCCTGA?GTTCAGACCG?GT

B、目的片段的克隆：以帶有Mex的質粒為模板，進行PCR擴增：模板1μL，上下游引物10μM各1μL，2.5mM的dNTP底物4μL，10倍緩沖液5μL，pfu聚合酶1μL，雙蒸水37μL；95℃變性2分鐘；然后94℃變性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸50秒，進行30-40個循環；最后72℃延伸7-10分鐘；

C、擴增產物純化：PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，將一條約647bp的擴增目的條帶切下，用Gel?Extraction?Kit?DNA純化試劑盒進行純化；

D、pMex真核載體的構建：

D-1、酶切：將載體用SmaI酶進行酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩沖液2μL，SmaI1μL，載體5μL，無離子水12μL，37℃水浴4個小時，酶切后的載體片段經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；

D-2、連接：回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應；

D-3、轉化大腸桿菌：將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐霉素100μL/mL的LB培養基上37℃培養12-16小時；

D-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆：將菌落放大培養，純化提取質粒；

D-5、利用SpeI進行酶切鑒定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒；

E、得到IRES-EGFP序列：在質粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，并經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，將一條約1300bp的目的條帶切下，用Gel?Extraction?Kit?DNA純化試劑盒進行純化；

F、pGreen?Max1真核表達載體的構建：

F-1、酶切：將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩沖液2μL，BamHI1μL，NotIμL，pMex載體5μL，無離子水12μL，37℃水浴4個小時，酶切后的載體片段經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收；

F-2、連接：回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應；

F-3、轉化大腸桿菌：將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐霉素100μL/mL的LB培養基上37℃培養12-16小時；

F-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆：將菌落放大培養，純化提取質粒；

F-5、利用HindIII進行酶切鑒定和測序，證實得到序列1的pGreen?Max1真核表達質粒。