[發(fā)明專利]一種羅素伐他汀中間體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310267953.X
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103361386A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陶軍華;唐蘇蘇;李斌;劉根
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N9/78;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥和生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的生物制備方法。

背景技術(shù)

心腦血管疾病是危害人類（特別是中老年）健康最常見、最嚴(yán)重的疾病之一。血脂異常是動脈粥樣硬化、冠心病以及其它心腦血管疾病的重要危險因素。根據(jù)近年衛(wèi)生部在全國范圍內(nèi)進(jìn)行的中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查顯示，總患病率為18.6％，全國患者總?cè)藬?shù)達(dá)1.6億。

調(diào)脂藥可有效降低此類疾病的發(fā)生率和死亡率，對心血管疾病的防治產(chǎn)生積極的作用和深遠(yuǎn)的影響。他汀類藥物（3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑）由于副作用較少，是目前世界上最為暢銷的降膽固醇和降血脂藥物。由阿斯利康(Astrazeneca)公司開發(fā)的羅素伐他汀(Rosuvastatin,英文商品名Crestor)于2002年11月首次在荷蘭獲批，2003年8月通過美國FDA上市審批，2009年在全球銷售額44億美元，排名第十七位。羅素伐他汀在藥效和安全性方面均達(dá)到令人滿意的結(jié)果，被稱為“超級他汀”。

羅素伐他汀的手性側(cè)鏈合成是其生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟。(R)-3-羥基戊二酸單甲酯及其后續(xù)的羥基被保護(hù)的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯是合成羅素伐他汀側(cè)鏈的重要手性前體。利用化學(xué)方法合成(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的方法，由于條件極端且水解無選擇性，極易破壞手性基團(tuán)和其它活性基團(tuán)，生成副產(chǎn)物，因此并沒有得到廣泛的應(yīng)用。

中國發(fā)明專利公開CN101805756A公開了一種生物催化法生產(chǎn)他汀類藥物中間體的方法，其中公開了利用消旋的4-氰基-3羥基丁酸乙酯生產(chǎn)(R)-3-羥基戊二酸乙酯。采取該方法，雖然能夠克服化學(xué)法的不足，但是消旋體水解后得到的目標(biāo)產(chǎn)品只有50%的理論得率，意味著一半的底物被浪費(fèi)，不符合綠色化學(xué)和原子經(jīng)濟(jì)性的原則，而且該方法的底物投料量較低，只有20mmol/L，不具有工業(yè)應(yīng)用的價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羅素伐他汀中間體(R)-3-羥基戊二酸單甲酯和羥基被保護(hù)的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，實現(xiàn)了接近100%的轉(zhuǎn)化率和高反應(yīng)底物濃度。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，該方法以(R)-4-氰基-3-羥基丁酸甲酯為底物，使其在酶的作用下反應(yīng)生成所述(R)-3-羥基戊二酸單甲酯，特別是，所述的酶為重組腈水解酶，該重組腈水解酶的制備方法為：將含有腈水解酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35～40℃下活化8～12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35～40℃下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8時，加入誘導(dǎo)劑，于25～33℃下繼續(xù)培養(yǎng)8～12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8～12分鐘，再離心，將上清液預(yù)凍至溫度降至-10℃～-25℃，然后冷凍干燥24～48小時，即得凍干的粉狀重組腈水解酶；所述的反應(yīng)在pH為7.0～9.0的水相緩沖液中以及溫度25℃～35℃下進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明，所述的誘導(dǎo)劑可以且優(yōu)選為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。所述的水相緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液。重組腈水解酶與底物的投料質(zhì)量比可以為0.01～0.1:1，優(yōu)選為0.02～0.05:1例如0.03:1。反應(yīng)起始時，底物濃度可以為0.8～1.5mol/L，優(yōu)選為1.0～1.5mol/L。

根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面：所述方法具體實施如下：將重組腈水解酶加入到水相緩沖液中，然后采用恒流泵流加底物，待底物加畢，使反應(yīng)體系在溫度25℃～35℃下以及攪拌下反應(yīng)，至底物轉(zhuǎn)化率大于等于99.0%，終止反應(yīng)。

進(jìn)一步地，終止反應(yīng)后，用鹽酸調(diào)節(jié)體系至酸性（例如pH2～6，優(yōu)選pH2～3），然后用硅藻土過濾，用乙酸乙酯沖洗濾渣；濾液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，濃縮后得到黃褐色油狀物即為(R)-3-羥基戊二酸單甲酯。

本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：

一種羥基被保護(hù)的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，該羥基被保護(hù)的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯為(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸單甲酯，其包括如下步驟：

（1）按照上述的方法制備得到(R)-3-羥基戊二酸單甲酯；