[發(fā)明專利]一種羅素伐他汀中間體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310267953.X
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103361386A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設計）人: 陶軍華;唐蘇蘇;李斌;劉根
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N9/78;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

1.一種(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，該方法以(R)-4-氰基-3-羥基丁酸甲酯為底物，使其在酶的作用下反應生成所述(R)-3-羥基戊二酸單甲酯，其特征在于：所述的酶為重組腈水解酶，該重組腈水解酶的制備方法為：將含有腈水解酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35～40℃下活化8～12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35～40℃下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD₆₀₀值達到0.6～0.8時，加入誘導劑，于25～33℃下繼續(xù)培養(yǎng)8～12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8～12分鐘，再離心，將上清液預凍至溫度降至-10℃～-25℃，然后冷凍干燥24～48小時，即得凍干的粉狀重組腈水解酶；所述的反應在pH為7.0～9.0的水相緩沖液中以及溫度25℃～35℃下進行。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：所述的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：重組腈水解酶與底物的投料質(zhì)量比為0.01～0.1:1，反應起始時，底物濃度為0.8～1.5mol/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：重組腈水解酶與底物的投料質(zhì)量比為0.02～0.05:1，反應起始時，底物濃度為1.0～1.5mol/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項權(quán)利要求所述的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：所述方法具體實施如下：將所述重組腈水解酶加入到水相緩沖液中，然后采用恒流泵流加底物，待底物加畢，使反應體系在溫度25℃～35℃下以及攪拌下反應，至底物轉(zhuǎn)化率大于等于99.0%，終止反應。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：終止反應后，用鹽酸調(diào)節(jié)體系至酸性，然后用硅藻土過濾，用乙酸乙酯沖洗濾渣；濾液用乙酸乙酯萃取，合并有機相；有機相用無水硫酸鈉干燥，濃縮后得到黃褐色油狀物即為(R)-3-羥基戊二酸單甲酯。

8.一種羥基被保護的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，所述羥基被保護的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯為(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸單甲酯，其特征在于：所述制備方法包括如下步驟：

（1）按照權(quán)利要求1至7中任一項權(quán)利要求所述的方法制備得到(R)-3-羥基戊二酸單甲酯；

（2）使(R)-3-羥基戊二酸單甲酯與叔丁基二甲基氯硅烷在有機溶劑中，催化劑和有機堿縛酸劑存在下，于常溫下攪拌反應，得到3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯，其中，(R)-3-羥基戊二酸單甲酯、叔丁基二甲基氯硅烷以及有機堿縛酸劑的投料摩爾比為0.4～0.5:1:1.05～1.2。

（3）使3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯在碳酸鉀存在下、溶劑中發(fā)生水解反應生成所述(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸單甲酯。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的羥基被保護的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，所述催化劑為4-二甲氨基吡啶，其與(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的投料摩爾比為0.002～0.01:1，所述有機堿縛酸劑為選自咪唑、N,N-二異丙基乙胺、吡啶及三乙胺中的一種或多種的組合。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的羥基被保護的(R)-3-羥基戊二酸單甲酯的制備方法，其特征在于：步驟（3）中，采用甲醇、四氫呋喃以及水的組合作為溶劑，所述碳酸鉀與3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯的投料摩爾比為4.5～5:1。