[發(fā)明專利]兩親性α螺旋自組裝肽及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310265579.X
• 申請(qǐng)日: 2013-06-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104250288B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林章凜;周碧紅;邢磊;趙青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K19/00;C12N15/11;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C12P21/00
• 代理公司: 北京永新同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11376
• 代理人: 程大軍,欒星明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的兩親性α螺旋自組裝肽及其在蛋白生產(chǎn)和純化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著人們對(duì)酶制劑、蛋白藥物等蛋白和多肽類產(chǎn)品的需求日益增加，利用原核系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用變得越來(lái)越廣泛。在原核系統(tǒng)中表達(dá)外源基因時(shí)，目的蛋白容易以不可溶的蛋白聚集體（也稱包涵體）的形式存在[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，包涵體是指多肽錯(cuò)誤折疊形成的沒(méi)有生物學(xué)活性的不可溶沉淀[2]。然而，蛋白以包涵體形式表達(dá)有很多優(yōu)點(diǎn)，比如蛋白表達(dá)量大、純度較高、分離操作簡(jiǎn)便、避免蛋白酶降解等，并且適用于生產(chǎn)對(duì)細(xì)胞有毒的外源蛋白或多肽。但是，包涵體形式表達(dá)的蛋白需經(jīng)過(guò)體外的變復(fù)性和純化操作才能得到具有生物活性的功能性蛋白。目前蛋白變復(fù)性技術(shù)仍存在成本高、收率低、技術(shù)復(fù)雜等問(wèn)題[3]，極大地限制了包涵體表達(dá)形式在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

活性聚集體的發(fā)現(xiàn)改變了人們對(duì)包涵體的傳統(tǒng)看法[4-6]。研究表明，通過(guò)調(diào)整表達(dá)條件或者融合表達(dá)能引起聚集的結(jié)構(gòu)單元可以得到具有部分活性的蛋白聚集體。這種不溶、具有生物活性的蛋白聚集體繼承了包涵體表達(dá)蛋白的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也避免了復(fù)雜的變復(fù)性操作。

本發(fā)明人先前的研究發(fā)現(xiàn)一些兩親性自組裝短肽在與目的蛋白融合表達(dá)時(shí)可以誘導(dǎo)融合蛋白在大腸桿菌中形成活性蛋白聚集體[7-9]。這樣的自組裝兩親性短肽二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，形成的聚集體比活性高，且制備十分方便。

本發(fā)明對(duì)已有的兩親性自組裝短肽進(jìn)行改造，使得可以改變活性聚集體在細(xì)胞內(nèi)的分布，改善了宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)提高目的蛋白的產(chǎn)量。這樣的改進(jìn)拓展了兩親性自組裝短肽在蛋白生產(chǎn)和純化方面的應(yīng)用。

發(fā)明概述

在第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其包含衍生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO:1相比含有選自K4E/E1K、K4E/E8K、K9E/E12K、K15E/E12K和K13E/E16K的一或多種雙突變，其中當(dāng)所述多肽作為與目的蛋白形成的融合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述融合蛋白能夠在所述宿主細(xì)胞內(nèi)形成活性聚集體。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述多肽作為與目的蛋白形成的融合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述融合蛋白的蛋白產(chǎn)量與由SEQ ID NO:1的多肽與所述目的蛋白形成的融合蛋白的蛋白產(chǎn)量相比是增加的。

在第二方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的上述的多肽。

在第三方面，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，其包含目的蛋白和本發(fā)明上述的多肽。在一些實(shí)施方案中，所述目的蛋白和所述多肽通過(guò)接頭相連。在一些實(shí)施方案中，所述接頭包含SEQ ID NO:40的序列。在另一些實(shí)施方案中，所述接頭包含切割位點(diǎn)。所述切割位點(diǎn)可以選自化學(xué)切割位點(diǎn)、酶法切割位點(diǎn)和自切割位點(diǎn)，優(yōu)選為自切割位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述自切割位點(diǎn)為內(nèi)含肽，例如序列示于SEQ ID NO:41的內(nèi)含肽。

在第四方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列。

在第五方面，本發(fā)明提供了表達(dá)構(gòu)建體，其包含本發(fā)明上述的多核苷酸。

在第六方面，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明上述的多核苷酸或以本發(fā)明上述的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，其中所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)所述融合蛋白。

在第七方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生和純化目的蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述融合蛋白；

(b)裂解所述宿主細(xì)胞，然后去除細(xì)胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分。