[發明專利]一種快速低成本純化CYP119酶的方法

有效

• 申請號: 201310264044.0
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103305482A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 蔣華麟;張為波;陳萍華;羅勝聯;羅旭彪
• 申請（專利權）人: 南昌航空大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發明涉及一種快速且成本低廉地純化CYP119酶的方法，屬于酶純化技術領域。

背景技術

CYP119（細胞色素P450?119）酶是一種細胞色素P450酶。CYP119酶來源于生長于高溫火山溫泉環境中的原始細菌Sulfolobus?solfataricus，具有超常的穩定性和耐受性。它的熱變性溫度高達90℃，并可以耐受200?MPa以上的高壓和極端的pH條件?；谝陨咸攸c，CYP119酶是極佳的生物催化劑，是蛋白質工程的理想目標，在生物制藥、生物合成等領域具有極其重要的應用價值。

目前CYP119酶的合成技術已經較為成熟，通常都是將CYP119酶的基因裝載入特定的表達載體，再轉化進特定的大腸桿菌細胞內，利用大腸桿菌進行生物合成。但是從合成了CYP119酶的大腸桿菌裂解液中提純CYP119酶的技術是一個難點，目前方法較為單調、耗時較長且花費昂貴。例如：Rabe等人利用Ni-NTA親和樹脂柱和MonoQ陰離子交換樹脂柱純化CYP119酶[ChemBioChem?2008,?9,?420-425]；Koo等人利用Q?Sepharose樹脂柱和PBE94樹脂柱純化CYP119[J.?Biol.?Chem.?2000,?275(19):?14112-14123];?Blair等人利用QAE-Sepharose-25樹脂柱純化CYP119酶。這些純化方法的特點都是利用親和樹脂柱來提純。酶與親和樹脂的結合、洗滌、洗脫等步驟都要用到多種不同的緩沖溶液，操作起來費時費力，而且所用的這些樹脂的價格很高，這為大規模批量化純化CYP119酶帶來了不便。

本方法涉及只利用熱沉淀和鹽析技術從大腸桿菌中提純CYP119酶，方法中只用到一種緩沖溶液，主要化學試劑是廉價的(NH₄)₂SO₄和KH₂PO₄，具有方便快速、成本低的特點，本方法涉及的只利用熱沉淀和鹽析技術從以pCWori為表達載體、以大腸桿菌DH5α為宿主菌的菌體裂解液中提純CYP119酶的方法未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速低成本純化CYP119酶的方法。

本發明采用如下手段：

（1）將含有CYP119酶的菌體裂解液，在60℃加熱1小時，離心去除沉淀，收集上清；

（2）在0.5小時內逐漸向由（1）所得上清中加入(NH₄)₂SO₄固體，至(NH₄)₂SO₄最終質量濃度為40%，離心去除沉淀，收集上清；

（3）在0.5小時內逐漸向由（2）所得上清中加入(NH₄)₂SO₄固體，至(NH₄)₂SO₄最終質量濃度為60%，離心去除上清，收集沉淀；

（4）將由（3）所得沉淀用10?mM?KH₂PO₄緩沖溶液（pH=2）在4℃緩慢攪拌溶解，即得到CYTP119酶的溶液。

本發明的優點是：（1）得到的CYP119酶純度高，從SDS-PAGE膠表征的結果來看，通過本方法純化得到的CYP119酶的純度在80%左右；?（2）得到的CYP119酶的活性好，從UV譜圖表征結果看，通過本方法得到的CYP119酶保持著正確的構象，具有很高的生物活性；（3）純化條件溫和，工藝操作簡便，時間短，成本低，適用于大規模提純CYP119酶。?

附圖說明

圖1為本發明所得CYP119酶的SDS-PAGE膠圖。圖上第1條道為純化后的CYP119酶，第2條道為分子量Marker。

圖2為本發明所得CYP119酶的UV光譜圖。

具體實施方式

實施例1

本發明所涉及的CYP119酶的表達載體為pCWori，宿主菌為大腸桿菌DH5α，CYP119酶的表達及大腸桿菌體的裂解采用的是常規通識的方法和步驟；

含有CYP119酶的大腸桿菌菌體經過裂解后，將裂解液在60℃條件下加熱1小時，15000r/min離心20分鐘，去除沉淀蛋白，將上清倒入一個干凈的燒杯；將上清置于在4℃環境下，緩慢攪拌，同時緩慢地加入(NH₄)₂SO₄固體，在半個小時內加完(NH₄)₂SO₄，使其最終質量百分比濃度達到40%。再在4℃緩慢攪拌2小時后，在4℃下10000r/min離心15min，去除沉淀蛋白，將上清倒入一個干凈的燒杯；將上清在4℃條件下緩慢攪拌，同時緩慢地加入(NH₄)₂SO₄固體，在半個小時內加完(NH₄)₂SO₄，使其最終質量百分比濃度達到60%，再在4℃緩慢攪拌2小時后，在4℃下10000r/min離心15min，去除上清，將沉淀轉入干凈小燒杯；將沉淀溶解于10?mM?KH₂PO₄緩沖溶液，pH=7.2，在4℃緩慢攪拌至沉淀完全溶解，得到紅色溶液，即為純化的CYP119酶溶液。如圖1所示，圖1為本發明所得CYP119酶的SDS-PAGE膠圖。圖上第1條道為純化后的CYP119酶，第2條道為分子量Marker。本發明所得CYP119酶的SDS-PAGE膠圖顯示CYP119酶的純度在80%左右；如圖2所示，本發明所得CYP119酶的UV光譜圖顯示在416nm處可見明顯的尖峰，在535?nm和565?nm可見兩個明顯的包峰，表明CYP119酶保持著正確的構象，具有很高的生物活性。