[發明專利]一種新的轉基因米曲霉檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310263785.7
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103497992A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 張裕君;趙衛東;劉國紅;賀艷;鄭文杰
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及轉基因微生物檢測技術領域，提供了一種利用PCR擴增和核酸試紙條技術相結合的快速檢測轉基因米曲霉的試劑盒，適用于轉基因米曲霉的快速檢測。?

背景技術

米曲霉(Aspergillus?oryzae)，屬于半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬，是真菌中的一個常見種。分布廣，主要在糧食、發酵食品、腐敗有機物和土壤等處。是我國傳統釀造食品醬和醬油的生產菌種。也可生產淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等，是一種非常重要的工業用菌種。?

目前酶制劑產品中的轉基因微生物檢測的技術還是主要依靠傳統分離培養的形態學檢測方法，檢測靈敏度低，通常需要幾天時間。近些年來，隨著分子生物學和生物技術的快速發展，PCR技術成了快速檢測的常用手段。但是擴增產物需要凝膠電泳，紫外凝膠成像，步驟多，耗時長，而且存在EB染色劑污染的問題。?

本研究通過巧妙地設計針對轉基因米曲霉的帶標記的特異性引物和探針，應用PCR擴增和核酸試紙條檢測技術，實現了轉基因米曲霉的高效快速檢測。該方法特異性強，靈敏度高、穩定性好，可以廣泛應用于轉基因米曲霉的準確快速檢測。?

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供用于檢測轉基因米曲霉的兩套特異性引物和探針。?

本發明需要解決的另一問題是提供包含上述引物的核酸試紙條檢測試劑盒。?

本發明用于檢測轉基因米曲霉的兩套PCR引物及探針序列為：?

上游引物1：PyrG-F-bio：5’biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3’?

下游引物1：PyrG-R：5’-GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’?

探針1：PyrG-P-fitc：5’fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3’?

上游引物2：Npl-F-bio：5’biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3’?

下游引物2：Npl-R：5’-AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’?

探針2：Npl-P-fitc：5’fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’?

本發明的轉基因米曲霉檢測試劑盒，包括以下成分：?

(1)轉基因米曲霉DNA模板和陰性對照野生型米曲霉模板?

(2)轉基因米曲霉帶標記的上、下游引物和探針?

上游引物1：PyrG-F-bio：5’biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3’?

下游引物1：PyrG-R：5’-GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’?

探針1：PyrG-P-fitc：5’fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3’?

上游引物2：Npl-F-bio：5’biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3’?

下游引物2：Npl-R：5’-AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’?

探針2：Npl-P-fitc：5’fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’?

(3)10×Taq?PCR?Buffer，DDH₂O，2.5mM?dNTP，5U／μl?Taq酶?

分別用上述方法對待測樣品DNA進行PCR擴增，PCR產物用試紙條檢測，兩套引物探針的檢測結果顯示控制線正常，檢測線呈現陽性，則說明該樣品含有轉基因米曲霉，若至少有一套引物、探針檢測結果呈現陰性，則說明該樣品中不含有轉基因米曲霉。?

與現有技術相比，本發明的進步在于：無需瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像，從而避免了溴化乙錠的污染，而且檢測結果直觀、可視，從PCR擴增到觀察結果只需100min左右，大大優于凝膠電泳成像。?

附圖說明

圖1、圖2轉基因米曲霉試劑盒特異性測試結果，其中圖1為PyrG特異性檢測、圖2為Npl特異性檢測，1為陰性對照，2、3、4、5、6、7為野生型米曲霉，8為轉基因米曲霉，從圖1、圖2可以看出，只有轉基因米曲霉出現特異條帶，使用本試劑盒能準確地檢測出轉基因米曲霉。?

具體實施方式

第一套PyrG特異引物、探針設計：?

第二套Npl引物探針設計：?