[發明專利]人白細胞介素35酶聯免疫吸附測定試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201310263621.4
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103353533A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 何峰容;楊娟;汪景;彭夫望;孫穎;高強;李慶;姚雯
• 申請（專利權）人: 武漢優爾生科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/544
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，涉及人白細胞介素35酶聯免疫吸附測定試劑盒及其制備方法。?

背景技術

白細胞介素35(IL35)，是最新發現的IL-12細胞因子家族成員，由兩個亞基組成的異二聚體，即EBI3和IL-12p35。EBI3由EB病毒感染的B淋巴細胞誘導產生，是編碼為34kDa的糖蛋白，27％的氨基酸與IL-12p40相同；IL-12p35與其他單鏈細胞因子如IL-6同源。IL-35從1997年發現，一直到2007年Collison等首次描述了IL-35的組成和功能，發現IL-35是由調節性T細胞(Regulatory?T-cells，Treg)分泌，并對免疫功能發揮調控效應的重要細胞因子。Treg細胞是一種重要的CD4+T細胞亞群，它在維持自我耐受，防止自身免疫病，限制慢性炎癥性疾病，調節淋巴細胞的穩態性擴增等方面發揮基本作用。它們同時也在抑制寄生蟲和病毒引起的自然免疫應答和疫苗誘導的抗腫瘤免疫效應中發揮重要作用。?

根據目前研究表明IL-35可刺激Treg細胞增殖；IL-35抑制Teff細胞增殖；IL-35抑制Th17細胞的分化，Th17細胞是近年來發現的一類獨立于Th1和Th2細胞的CD4+效應T細胞，已有研究證明，Th17細胞與炎癥性疾病特別是關節炎的發生有密切關系，并且動物試驗表明IL-35能緩解小鼠實驗性關節炎。研究還證實IL-35與炎癥性腸炎，過敏性氣道疾病，自身免疫性疾病有關。IL-35的?發現具有非常重要的意義，因為對調節型T細胞的調控是免疫治療的一個重要目標。IL-35是少數的能抑制免疫系統活性的信號分子，因此對IL-35功能的調控可以為免疫治療提供一個新穎的思路，IL-35是新近治療腫瘤、感染性疾病和自身免疫病的新靶點。?

正因為IL-35是新近發現的細胞因子，目前市場上針對其的檢測工具很少。酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測技術是利用抗原-抗體之間特異性的免疫反應識別生物液體中的靶分子，并利用酶-底物的顯色反應定量的反應待測樣本中靶分子的含量。由于其特異性強、靈敏度、操作簡便及不需大型儀器等優點，現廣泛用于生物樣本的定量檢測實驗中。ELISA檢測的關鍵問題是得到質量高的抗原和抗體。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種人白細胞介素35酶聯免疫吸附測定試劑盒及其制備方法。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：?

本發明一方面涉及一種人白細胞介素35酶聯免疫吸附測定試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括小鼠抗IL-12p35單克隆抗體(包被抗體)、全長重組蛋白IL-35(標準品)、生物素化的小鼠抗IL-27EBI3單克隆抗體(檢測液A)、底物TMB和終止液。?

在一個優選的實施方式中，所述的試劑盒以聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，該固定相表面依次有包被層和封閉層，其中包被層中包括小鼠抗IL-12p35單克隆抗體，封閉層包括牛血清蛋白；試劑盒中還包括通過重疊PCR技術制備的全長IL-35標準品蛋白、含有生物素化的小鼠抗IL-27EBI3單克隆抗?體檢測液A以及含有親和素化辣根過氧化物酶(HRP)作為檢測液B。?

在本發明的一個優選實施方式中，所述的試劑盒通過包括如下步驟在內的方法所制備而成：?

使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時，使PS板活化；?

在試劑板微孔條上預先包被一定濃度的小鼠抗IL-12p35單克隆抗體(此抗體是通過制備的重組蛋白IL12p35免疫小鼠篩選單抗而獲得)，4℃過夜，經洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標板；?

利用重疊PCR制備全長IL35蛋白作為試劑盒的標準品；?

配制以生物素化的小鼠抗IL-27EBI3單克隆抗體(此抗體是通過制備的重組蛋白IL27EBI3免疫小鼠篩選單抗而獲得)為活性成分的檢測液A；?

配制以親和素化辣根過氧化物酶(HRP)作為檢測液B。?

在本發明的一個優選實施方式中，所述的小鼠抗IL-12p35單克隆抗體的制備方法包括如下步驟：?

A.IL-12p35基因片段的擴增，參照的基因序列為Genebank號NM_000882.3。根據查到的基因分別設計IL-12p35基因上下游引物，以人cDNA為模板擴增IL-12p35基因片段：?

IL-12p35上游引物：?

5’-ACGCGTCGACAAAGAAACCTCCCCGTGGCCACTC-3’?

IL-12p35下游引物：?