[發明專利]脂多糖酶聯免疫吸附測定試劑盒的制備方法

有效

• 申請號: 201310263605.5
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103308686A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 彭夫望;何峰容;楊娟;汪景;孫穎;高強;李慶;萬定一
• 申請（專利權）人: 武漢優爾生科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/545
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，涉及脂多糖(LPS))酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒的制備方法。

背景技術

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌的內毒素，由特異性多糖、核心多糖和脂類A組成，借疏水鍵與外膜相連。做為細胞壁的組成成份，LPS僅在細菌自溶或人工裂解后才釋放出來。脂類A是LPS的毒性中心，也是內毒素的主要成份。脂類A無種屬特異性，故各種不同革蘭氏陰性菌感染，由內毒素產生的毒性作用大致相似。

LPS的生物學活性多種多樣，尤其在機體內的表現，錯綜復雜，各單項活性之間常相互聯系，相互促進或制約。LPS具有激活生物體內巨噬細胞等效應靶細胞誘導產生多種活性因子的作用。LPS作用于機體后可以刺激機體產生腫瘤壞死因子、IL-1、IL-6、干擾素、集落刺激因子等多種細胞因子，刺激產生大量活性氧，引起機體發熱、彌散性血管內凝血、多臟器衰竭及休克等臨床綜合征。有實驗證明給動物注射少量的LPS，早期白細胞數量減少，后期白細胞數量明顯增加；另外LPS還具有激活補體活化的經典途徑和旁路途徑。活化過程中產生的C3a、C5a具有過敏性毒素作用；內毒素可導致動物發生什瓦茨曼(shwartzman)現象；LPS具有免疫佐劑活性；內毒素注射入實驗動物，常可導致動物死亡等作用。

因此，制備一種能特異、靈敏、快速的檢測LPS的工具是非常有需要的而且有意義的。它可以用來檢測生物重組藥物、食物、科學研究蛋白中LPS的殘留。而酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測技術正好可以滿足這些要求。ELISA檢測技術是利用抗原-抗體之間特異性的免疫反應識別生物液體中的靶分子，并利用酶-底物的顯色反應定量的反應待測樣本中靶分子的含量。由于其特異性強、靈敏度、操作簡便及不需大型儀器等優點，現廣泛用于生物樣本的定量檢測實驗中。實現該測定的重要環節是針對待測分子的高特異性、高親和力抗體的制備。

LPS是一種結構十分復雜、具有多種異質性的生物大分子，而且屬于胸腺非依賴抗原(TI抗原)。與蛋白質等胸腺依賴性抗原(TD抗原)不同，TI抗原不能誘導抗體親和成熟，也不能誘導免疫記憶，所以按常規的免疫方法很難產生高親和力、交叉反應性抗LPS的mAb。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種脂多糖(LPS))酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒的制備方法。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案：

本發明一方面涉及一種脂多糖(LPS))酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒的制備方法，所述的方法包括如下步驟：

a、LPS與載體蛋白BSA偶聯復合物的制備：

取LPS和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(質量比4-6∶2)溶解在PBS溶液中；攪拌狀態下反應液里滴加含有碳二亞胺的PBS溶液中，室溫反應過夜；將上清液逐滴加到含有BSA的磷酸鹽緩沖液中；室溫攪拌反應5h；裝入透析袋透析、濃縮、干燥保存；

b、抗LPS抗體的制備：

選用BALB/C小鼠，將LPS-BSA蛋白濃度調整為1mg/mL，然后取0.4ml蛋白與等量完全弗氏佐劑混合、乳化，每只100ul，皮下多點及四腳掌初次免疫，14d后相同劑量腹腔加強免疫，每2周加強1次，加強后每隔7d眼眶采血，分別測定針對LPS和載體蛋白的抗體效價，于細胞融合前3d尾靜脈加強免疫；用PEG融合處于對數生長期的骨髓瘤細胞和BALB/C小鼠脾細胞，制備雜交瘤細胞；2周后用間接ELISA法檢測細胞上清液，選取P/N值最高的采用有限稀釋法進行3-4次克隆；每次克隆后擴大培養建庫的細胞上清。用硫酸銨沉淀法粗提單抗，用親和層析法純化分離得到特異性高的抗LPS的抗體；

c、試劑盒的制備

使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時，使PS板活化；在試劑板微孔條上預先包被一定濃度的抗LPS抗體，4℃過夜，經洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標板；配制以生物素化的LPS為活性成分的檢測液A。

具體實施方式

下面通過實施例詳細敘述本發明的技術內容：

1.LPS酶聯免疫試劑盒的制備方法，其具體步驟為

a、LPS與載體蛋白BSA偶聯復合物的制備：