[發明專利]脂多糖酶聯免疫吸附測定試劑盒的制備方法

有效

• 申請號: 201310263605.5
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103308686A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 彭夫望;何峰容;楊娟;汪景;孫穎;高強;李慶;萬定一
• 申請（專利權）人: 武漢優爾生科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/545
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種脂多糖(LPS))酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒的制備方法，所述的方法包括如下步驟：

a、LPS與載體蛋白BSA偶聯復合物的制備：

取LPS和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(質量比6-4∶2)溶解在PBS溶液中；攪拌狀態下反應液里滴加含有碳二亞胺的PBS溶液中，室溫反應過夜；將上清液逐滴加到含有BSA的磷酸鹽緩沖液中；室溫攪拌反應5h；裝入透析袋透析、濃縮、干燥保存；

b、抗LPS抗體的制備：

選用BALB/C小鼠，將LPS-BSA蛋白濃度調整為1mg/mL，然后取0.4ml蛋白與等量完全弗氏佐劑混合、乳化，每只100ul，皮下多點及四腳掌初次免疫，14d后相同劑量腹腔加強免疫，每2周加強1次，加強后每隔7d眼眶采血，分別測定針對LPS和載體蛋白的抗體效價，于細胞融合前3d尾靜脈加強免疫；用PEG融合處于對數生長期的骨髓瘤細胞和BALB/C小鼠脾細胞，制備雜交瘤細胞；2周后用間接ELISA法檢測細胞上清液，選取P/N值最高的采用有限稀釋法進行3-4次克??；每次克隆后擴大培養建庫的細胞上清。用硫酸銨沉淀法粗提單抗，用親和層析法純化分離得到特異性高的抗LPS的抗體；

c、試劑盒的制備

試劑盒的主要組分包括：包被抗體、LPS標準品、生物素標記的LPS、HRP標記的親和素、5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)和終止液(硫酸)；使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時，使PS板活化；在試劑板微孔條上預先包被一定濃度的抗LPS抗體，4℃過夜，經洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標板。