[發明專利]奶牛瓣胃上皮細胞體外分離、培養以及保存和復蘇方法

無效

• 申請號: 201310263564.X
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103289950A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 許慶彪;解瑩明;劉紅云;吳躍明;劉建新
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術領域

本發明涉及組織與細胞工程、轉基因動物等研究領域，特別是上皮細胞的分離、純化、培養、凍存和復蘇的方法。

背景技術

瓣胃上皮可以吸收大量小肽和氨基酸等多種營養物質，對奶牛營養吸收有重要意義。動物細胞培養模型在一定程度上模擬體內環境而廣泛應用于醫學、生物學、毒理學和營養學等領域，可用于研究細胞的形態、生長發育、細胞營養和代謝以及病變等微觀過程，進行外源性物質吸收機制、轉運途徑及作用機理等方面的研究。從復雜的器官體外培養到簡單的單一上皮細胞培養，可以很好的解決對于特定因素研究的問題，國內外很少有對奶牛瓣胃上皮細胞的體外培養的報告，并且僅限于短期的原代培養，對于其形態學、免疫鑒定、微觀結構觀察、冷凍保存以及吸收功能的研究就更少了；通過研究瓣胃上皮細胞的吸收功能和相關基因的表達，可以揭示奶牛前胃是如何吸收小肽等營養物質的、奶牛相關營養物質轉運載體的吸收特征以及營養供應和相關基因表達間的關系。

細胞的原代培養是從體內取出細胞開始培養到第一次進行傳代之前的時期，是一個特征性的必然生長階段。細胞完成了從體內環境到體外環境的過渡和適應過程，恢復了分裂增殖與生長發育的能力；對瓣胃上皮細胞的原代培養是構建細胞吸收模型系統的基礎。

瓣胃上皮細胞是高度分化的體細胞，其體外培養存在一定的困難，特別是細胞原代分離所需的胰蛋白酶濃度和消化時間，這兩個因素對分離下來的細胞活力影響很大，關系到原代培養的成功與否，目前對于奶牛瓣胃上皮細胞的體外培養技術一直不成熟，也很少有文獻報道，本發明找到了分離瓣胃上皮細胞的最佳酶濃度和消化時間等因素，從而解決了這一難題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種奶牛瓣胃上皮細胞體外分離、培養以及保存和復蘇方法。

一種奶牛瓣胃上皮細胞體外分離方法，包括以下步驟：

1）瓣胃組織的取樣

選用已經與奶牛相分離的瓣胃，剪取瓣胃葉，清洗、處理后得到瓣胃組織塊，備用；

2）細胞分離

將步驟1）所得的瓣胃組織塊放入容器中，加入2%～3%（M/V）的胰蛋白酶消化液消化1?h，棄上清液，再加入胰蛋白酶消化液繼續消化30?min，取上清液觀察，當視野中出現大量形態結構一致的細胞時，開始收集上清液得到含有細胞的收集液，此后每15-30?min收集一次，并向各收集液中加入血清終止消化，所得的細胞懸液經過濾和離心，得到分離的瓣胃上皮細胞。

?步驟1）中，所述的清洗中清洗液為添加了5倍雙抗和2倍兩性慶大霉素D-Hanks液；步驟2）中質量百分比濃度為2%～3%胰酶的消化液是用D-Hanks液配制的。

?一種所述的方法得到的分離的瓣胃上皮細胞的培養方法，用含抗生素的D-Hanks液清洗所述的分離的瓣胃上皮細胞多遍；然后調整細胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接種于鋪過鼠尾膠原的培養瓶中，置于37℃、5%?CO₂、飽和濕度條件下利用瓣胃上皮細胞培養液培養得到原代培養的瓣胃上皮細胞；所述的瓣胃上皮細胞培養液通過每毫升DMEM培養液中添加0.1?ml胎牛血清、10?ng表皮生長因子、5?μg胰島素、6.8?μmol谷氨酰胺、100?IU青霉素、100?μg鏈霉素和2.5?μg兩性霉素B制備得到。

所述的分離的瓣胃上皮細胞進一步純化，所述的純化方法為刮除法、差酶法、或差速貼壁法。

所述的分離的瓣胃上皮細胞進一步純化后，經離心得瓣胃上皮細胞，接著用所述的培養液清洗后；去掉上清液，用所述的培養液重新懸浮細胞，并調整細胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接種于細胞培養瓶，置于37℃、5%?CO₂、飽和濕度條件下培養，每隔1天換一次液得到傳代培養的瓣胃上皮細胞。

?一種得到的原代培養的瓣胃上皮細胞或得到的傳代培養的瓣胃上皮細胞的保存和復蘇方法，包括以下步驟：

1.1）制備冷凍保護液

冷凍保護液由以下體積百分比的組分組成：10%?DMSO、20%胎牛血清和70%細胞懸液；所述細胞懸液是由細胞與DMEM基礎培養基形成的混合物，裝于凍存管中，所述細胞為純化后的原代培養的瓣胃上皮細胞或傳代培養的瓣胃上皮細胞；

2.1）將上述步驟1.1）所得的冷凍保護液逐步慢速降溫：

a、將凍存管放入加了新鮮異丙醇的凍存盒中，放入-80℃冰箱過夜，降溫速率為1℃/min；