[發明專利]奶牛瓣胃上皮細胞體外分離、培養以及保存和復蘇方法

無效

• 申請號: 201310263564.X
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103289950A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 許慶彪;解瑩明;劉紅云;吳躍明;劉建新
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

1.一種奶牛瓣胃上皮細胞體外分離方法，其特征是，包括以下步驟：

1）瓣胃組織的取樣

選用已經與奶牛相分離的瓣胃，剪取瓣胃葉，清洗、處理后得到瓣胃組織塊，備用；

2）細胞分離

將步驟1）所得的瓣胃組織塊放入容器中，加入2%～3%（M/V）的胰蛋白酶消化液消化1?h，棄上清液，再加入胰蛋白酶消化液繼續消化30?min，取上清液觀察，當視野中出現大量形態結構一致的細胞時，開始收集上清液得到含有細胞的收集液，此后每15-30?min收集一次，并向各收集液中加入血清終止消化，所得的細胞懸液經過濾和離心，得到分離的瓣胃上皮細胞。

2.根據權利要求1所述的奶牛瓣胃上皮細胞體外分離方法，其特征是：步驟1）中，所述的清洗中清洗液為添加了5倍雙抗和2倍兩性慶大霉素D-Hanks液；步驟2）中質量百分比濃度為2%～3%胰酶的消化液是用D-Hanks液配制的。

3.一種根據權利要求1中所述的方法得到的分離的瓣胃上皮細胞的培養方法，其特征是，用含抗生素的D-Hanks液清洗所述的分離的瓣胃上皮細胞多遍；然后調整細胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接種于鋪過鼠尾膠原的培養瓶中，置于37℃、5%?CO₂、飽和濕度條件下利用瓣胃上皮細胞培養液培養得到原代培養的瓣胃上皮細胞；所述的瓣胃上皮細胞培養液通過每毫升DMEM培養液中添加0.1?ml胎牛血清、10?ng表皮生長因子、5?μg胰島素、6.8?μmol谷氨酰胺、100?IU青霉素、100?μg鏈霉素和2.5?μg兩性霉素B制備得到。

4.根據權利要求3所述的培養方法，其特征是，所述的分離的瓣胃上皮細胞進一步純化，所述的純化方法為刮除法、差酶法、或差速貼壁法。

5.根據權利要求4所述的培養方法，其特征是，所述的分離的瓣胃上皮細胞進一步純化后，經離心得瓣胃上皮細胞，接著用所述的培養液清洗后；去掉上清液，用所述的培養液重新懸浮細胞，并調整細胞密度，以1×10⁴/ml～1×10⁵/ml的密度接種于細胞培養瓶，置于37℃、5%?CO₂、飽和濕度條件下培養，每隔1天換一次液得到傳代培養的瓣胃上皮細胞。

6.一種根據權利要求3得到的原代培養的瓣胃上皮細胞或權利要求5得到的傳代培養的瓣胃上皮細胞的保存和復蘇方法，其特征是包括以下步驟：

1.1）制備冷凍保護液

冷凍保護液由以下體積百分比的組分組成：10%?DMSO、20%胎牛血清和70%細胞懸液；所述細胞懸液是由細胞與DMEM基礎培養基形成的混合物，裝于凍存管中，所述細胞為純化后的原代培養的瓣胃上皮細胞或傳代培養的瓣胃上皮細胞；

2.1）將上述步驟1.1）所得的冷凍保護液逐步慢速降溫：

a、將凍存管放入加了新鮮異丙醇的凍存盒中，放入-80℃冰箱過夜，降溫速率為1℃/min；

b、將上述步驟所得的-80℃的冷凍保護液直接利用液氮降溫，直至冷凍保護液被降溫至-196℃；

將上述-196℃的冷凍保護液采用液氮冷凍保存;

3.1）將上述步驟2.1）中的凍存細胞進行解凍復蘇培養：

a、從液氮中取出凍存管，放在37℃的水浴中晃動1-2?min，使其快速融化；

b、向凍存液中緩慢加入5?ml培養液懸浮細胞，1000?rpm離心5?min，去上清液，收集細胞，再用培養液清洗2遍，收集細胞，培養液重懸細胞，接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5%?CO₂、飽和濕度條件下培養，當細胞生長至80%匯合度時，傳代擴大培養。