[發(fā)明專利]卡介菌復(fù)合多糖及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310262024.X
• 申請(qǐng)日: 2013-06-27
• 公開（公告）號(hào): CN103305567A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高戈;高梓博;高潔生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/04
• 分類號(hào): C12P19/04;C08B37/00;A61K31/715;A61K45/00;A61P37/02;A61P11/00;A61P11/06;A61P37/08;A61P31/00;A61P35/00;C12R1/32
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從卡介菌細(xì)胞壁中提取的卡介菌復(fù)合多糖的方法和提取的卡介菌復(fù)合多糖的用途。

背景技術(shù)

卡介菌多糖核酸是原湖南醫(yī)科大學(xué)自20世紀(jì)70—90年代研發(fā)的新型生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。大量的研究顯示，本品具有抗過敏、抗胞內(nèi)感染、抗腫瘤等較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)藥理作用，臨床用于防治感冒、哮喘等療效好。其主要作用機(jī)制是：（1）誘導(dǎo)Th₀細(xì)胞分化成Th₁型細(xì)胞亞群，促進(jìn)其分泌γ－干擾素（IFN－γ）、白介素－2（IL－2），刺激B細(xì)胞合成IgG2a，抑制合成IgG1，具有免疫調(diào)節(jié)和抗過敏作用；（2）增強(qiáng)單核－巨噬細(xì)胞功能，小鼠經(jīng)腹腔注射本品，其腹腔巨噬細(xì)胞（MФ）數(shù)量增加，分泌酸性磷酸酶、溶菌酶增多，對(duì)胞內(nèi)感染菌，如人型結(jié)核菌、白色念珠菌、仙臺(tái)病毒等有殺滅作用；（3）增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK）活性，促使外周血中的γ/δT細(xì)胞擴(kuò)增10～20倍，具有填補(bǔ)早期NK細(xì)胞及共性吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性抵抗力和晚期αβT細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答間的“空隙”（gap）作用，調(diào)節(jié)趨化、活化病變中的αβT細(xì)胞，具有抗腫瘤、抗胞內(nèi)感染作用；（4）促進(jìn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）的細(xì)胞毒作用，從另一個(gè)角度發(fā)揮抗腫瘤、抗胞內(nèi)感染的作用。本發(fā)明的負(fù)責(zé)人之一（高潔生）曾主持卡介菌多糖核酸防治兒童哮喘的研究，獲得良好的臨床療效。其論文評(píng)為國際優(yōu)秀論文；其治療方法納入全國兒童哮喘診斷治療方案[中華兒科雜志，1998，36（12）：747]；其研究成果于1997年獲得湖南省科委科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)[湘科獎(jiǎng)學(xué)（97）第002號(hào)，項(xiàng)目編號(hào)：9713204]。目前，市面上已有湖南九芝堂斯奇康生物制藥有限公司生產(chǎn)的“斯奇康”（卡介菌多糖核酸注射液），0.5mg/支，經(jīng)肌肉注射給藥，被批準(zhǔn)用于治療慢性支氣管炎、感冒、哮喘。但是，該產(chǎn)品推薦的使用劑量和給藥時(shí)間為每次0.5mg,隔日1次，與我們研發(fā)使用的1.0mg，每3日1次不同。另一方面，眾多的研究表明，某些細(xì)菌、植物中藥來源的多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，如丸山疫苗，它是人型結(jié)核桿菌青山株的提取物，其主要成分為阿拉伯甘露聚糖，?1992年日本厚生省批準(zhǔn)該藥作為治療后腫瘤患者的白血病減少的藥物（藥品名?Ancer-20）；還有黃芪多糖、香菇多糖等。由于當(dāng)時(shí)的條件和時(shí)間限制，沒有進(jìn)一步對(duì)卡介菌多糖核酸各個(gè)組分做進(jìn)一步研究。因此需要挖掘卡介菌細(xì)胞壁中的復(fù)合多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的更大作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種卡介菌復(fù)合多糖及其制備方法和用，以解決上述背景技術(shù)中的問題。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種卡介菌復(fù)合多糖的制備方法，包括以下步驟：

???（1）將含有卡介菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代培養(yǎng)物繼續(xù)接種于蘇通培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)展培養(yǎng)至生長成乳白色至暗橙色菌膜；

???（2）復(fù)合多糖粗提：將上述培養(yǎng)物經(jīng)煮沸提取，離心去沉淀，用極性有機(jī)溶劑在2-6℃沉淀復(fù)合多糖，獲得粗制復(fù)合多糖；

???（3）復(fù)合多糖精制：將上述粗制復(fù)合多糖經(jīng)陰離子交換柱及超濾處理后，冷凍干燥獲得精制復(fù)合多糖，即卡介菌復(fù)合多糖。

作為進(jìn)一步的方案：步驟（1）具體包括以下步驟：

1）制備蘇通液體培養(yǎng)基：將天門冬素?4.0g、MgSO₄.7H₂O??0.5g、枸櫞酸?2.0g、枸櫞酸鐵胺?0.05g?、K₂HPO₄?0.5g、丙三醇?6ml溶于800?ml蒸餾水中，待溶解后加蒸餾水至1000ml，以氨水調(diào)PH至7.2，再過濾后分裝100?ml錐形瓶，102.9KPa高壓滅菌20分鐘，待冷后作無菌試驗(yàn)，置4℃冰箱保存；

2）菌種的擴(kuò)大保存：接種卡介菌標(biāo)準(zhǔn)菌株至制備好的蘇通液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)14-28天，待菌生長濃密至生長成乳白色至暗橙色菌膜，置4℃?zhèn)溆茫?/p>

3）液體培養(yǎng)：接種卡介菌標(biāo)準(zhǔn)菌株至制備好的蘇通液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)14-28天，待菌生長濃密后，離心去沉淀。

作為進(jìn)一步的方案：卡介菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存與鑒定：卡介菌丹麥株接種用羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存；增菌接種前，先經(jīng)蘇通培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)后，對(duì)細(xì)菌生長情況進(jìn)行檢定，并經(jīng)耐酸染色和革蘭染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；將鑒定合格的傳代培養(yǎng)物繼續(xù)接種于蘇通培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)4周；由于本菌為表面生長，在蘇通液體培養(yǎng)基表面生長成乳白至暗橙色菌膜。