[發明專利]甲基化CpG島的高通量測序檢測方法

有效

• 申請號: 201310259709.9
• 申請日: 2013-06-27
• 公開（公告）號: CN104250663B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 文路;李靜宜;黃巖誼;湯富酬
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及利用高通量測序技術檢測基因組中的甲基化CpG島。

背景技術

DNA甲基化是指在DNA上的胞嘧啶(C)的第5個碳原子上被甲基共價修飾成為5’甲基胞嘧啶(5mC)，它具有多種重要的生物學功能，包括轉錄調控，轉座子沉默、基因印記和X染色體失活等，一直是分子生物學領域的一個研究熱點。在包括人類在內的脊椎動物中，DNA甲基化修飾絕大多數發生在CpG位點上(CpG表示核苷酸對，其中鳥嘌呤(G)在DNA鏈上緊隨C后)。CpG在脊椎動物基因組中的平均含量低于預期概率，但在基因組某些區段，CpG保持或高于正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位于基因啟動子，在人類基因組中，約有3萬個CpG島，其中50％以上位于啟動子，而60％以上的基因啟動子含有CpG島。啟動子CpG島一旦被甲基化將導致相應基因表達沉默，已有研究表明這種機制參與了多種生理過程的調控，包括X染色體失活、基因印記、胚胎干細胞分化、生殖細胞發育以及腫瘤的發生和發展。基因內和基因間的CpG島可能是尚未鑒定的啟動子。全面理解CpG島甲基化的生物學功能需要系統和高效的檢測技術。

傳統檢測DNA甲基化的方法，包括限制性酶切、限制性酶切-PCR、甲基化特異性PCR，只能檢測單個或少數位點。近年來，隨著高通量測序技術的發展，人們開始能夠系統地從全基因組水平了解DNA甲基化譜式。目前基于高通量測序技術的DNA甲基化檢測方法包括：1)甲基化DNA免疫沉淀；2)甲基化CpG免疫沉淀和3)亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite Sequencing)。前二者采用抗體或重組甲基化CpG結合蛋白捕獲甲基化DNA，隨后進行高通量測序，這兩種方法只能對DNA甲基化狀態進行半定量檢測，其分辨率為100bp左右。亞硫酸氫鹽測序的原理是亞硫酸氫鹽處理能使得DNA上的C轉變成為尿嘧啶(U)，而5mC則不受影響，因此隨后進行高通量測序就可以得知DNA上的甲基化修飾情況。這種方法的分辨率精確到單個堿基，是DNA甲基化分析的金標準。2009年第一次報道了亞硫酸氫鹽測序獲得的單堿基分辨率人類全基因組甲基化圖譜。但是，由于這種技術是對全基因組進行測序，費用非常高，阻礙其應用于大量樣本的檢測。隨后有研究者提出了簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(Gu H，et al.Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling.Nat Protoc.20116(4)：468-81.)，這種方法通過Mspl酶切、跑膠、純化步驟富集啟動子及CpG島區域，隨后進行末端修復、加A、接頭連接、片段選擇純化和PCR擴增等步驟構建測序文庫，雖然比全基因組亞硫酸氫鹽測序更加經濟和高效，但是文庫構建過程繁瑣，需要大約5～6天時間，而且富集過程不能區分甲基化和非甲基化CpG島，增加了測序成本。專利(高通量測序文庫的構建方法及其應用，CN103103624A)利用特異性探針捕獲包括CpG島在內的目的片段，然后進行亞硫酸氫鹽測序，但序列捕獲和文庫構建過程同樣相當費時。

因此，目前尚缺乏一種高效的甲基化CpG島高通量測序檢測方法。

發明內容

本發明方法通過高CpG頻率引物對修飾劑轉換的基因組DNA中的甲基化CpG島進行富集性擴增，同時通過三步PCR反應將接頭序列連接到待測目的片段，得以高效地富集甲基化CpG島及快速地構建高通量測序文庫，是一種新穎、高效和經濟的甲基化CpG島高通量測序檢測方法。

在第一方面，本發明提供了甲基化CpG島的高通量測序檢測方法，包括下列步驟：

步驟一、用修飾劑處理DNA樣品，以便將DNA樣品中的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不變，獲得經過轉換的DNA片段。

DNA可以是任何包含脫氧核苷酸的聚合物。優選地，所述DNA樣品為基因組DNA，來源于動物、植物和微生物中至少一種，優選所述動物為人和小鼠中至少一種。

所述DNA樣品可以來自人的細胞、組織、血液、體液、尿液、排泄物或其組合；在一個優選的形式中，所述DNA樣品來自人的血漿或血清游離DNA；任選地，所述DNA樣品來自人的全血基因組DNA；任選地，所述DNA樣品來自人的腫瘤細胞株；