[發(fā)明專利]甲基化CpG島的高通量測序檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310259709.9 | 申請日： | 2013-06-27 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN104250663B | 公開（公告）日： | 2017-09-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 文路;李靜宜;黃巖誼;湯富酬 | 申請（專利權(quán)）人： | 北京大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/68 | 分類號(hào)： | C12Q1/68;C12N15/10;C40B50/06 |
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| 地址： | 100871*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 甲基化 cpg 通量 檢測 方法 | ||
1.一種甲基化CpG島的高通量測序檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：
步驟一、用修飾劑處理DNA樣品，以便將DNA樣品中的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不變，獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段；
步驟二、將所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段用引物A和DNA聚合酶進(jìn)行至少1次線性擴(kuò)增，以便獲得一端能夠錨定接頭引物C的目的片段；
其中所述引物A由3’端和5’端兩部分組成，其中所述3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段，其特征為，長度大于或等于4個(gè)核苷酸且能結(jié)合所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段；
其中所述引物A的5’端部分用于錨定接頭引物C，其特征為，其反向互補(bǔ)序列能夠被接頭引物C結(jié)合并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增；
步驟三、將所述一端能夠錨定接頭引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，以便獲得富集甲基化CpG島且兩端能夠分別錨定接頭引物C和接頭引物D的目的片段；
其中所述引物B由3’端和5’端兩部分組成，其中所述3’端部分用于結(jié)合所述一端能夠錨定接頭引物C的目的片段并富集性擴(kuò)增甲基化CpG島，其特征為：1)長度大于或等于7個(gè)核苷酸；2)高CpG頻率，其所述高CpG頻率一是指3’端起前7個(gè)核苷酸中包含2個(gè)或3個(gè)CpG；3)高GC含量，其所述高GC含量是指3’端起前10個(gè)核苷酸中C與G之和大于或等于7個(gè)，使其退火溫度達(dá)到40度至60度之間；
其中所述引物B的5’端部分用于錨定接頭引物D，其特征為，其反向互補(bǔ)序列能夠被接頭引物D結(jié)合并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
步驟四、將所述富集甲基化CpG島且兩端能夠分別錨定接頭引物C和接頭引物D的目的片段用接頭引物C、接頭引物D和DNA聚合酶進(jìn)行PCR指數(shù)擴(kuò)增，以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
步驟五、將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，所述擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成高通量測序文庫；以及，
將所述高通量測序文庫上機(jī)測序及數(shù)據(jù)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述修飾劑為亞硫酸氫鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述引物A的3’端部分特征為，除了CpG以外，引物只包含C、A和T；所述引物B的3’端部分特征為，除了CpG以外，引物只包含G、A和T。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，所述引物A的3’端第二個(gè)核苷酸為C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島，其特征為中等CpG頻率，其所述中等CpG頻率是指引物3’端起前7個(gè)核苷酸中包含1個(gè)CpG。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島，其特征為高C頻率，其所述高C頻率是指3’端起前5個(gè)核苷酸中至少包含3個(gè)C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島，其特征為高CpG頻率，其所述高CpG頻率是指3’端起前7個(gè)核苷酸中包含2個(gè)或3個(gè)CpG。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，所述引物B的3’端部分特征為極高CpG頻率，其所述極高CpG頻率是指3’端7個(gè)核苷酸中包含3個(gè)CpG。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟二中的DNA聚合酶具有鏈置換功能。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟二中的DNA聚合酶是外切核酸酶缺損的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟二進(jìn)行2～30次線性擴(kuò)增。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟三中的DNA聚合酶是熱啟動(dòng)的。
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