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[發(fā)明專利]甲基化CpG島的高通量測序檢測方法有效

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201310259709.9 申請日: 2013-06-27
公開(公告)號(hào): CN104250663B 公開(公告)日: 2017-09-15
發(fā)明(設(shè)計(jì))人: 文路;李靜宜;黃巖誼;湯富酬 申請(專利權(quán))人: 北京大學(xué)
主分類號(hào): C12Q1/68 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/10;C40B50/06
代理公司: 暫無信息 代理人: 暫無信息
地址: 100871*** 國省代碼: 北京;11
權(quán)利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 甲基化 cpg 通量 檢測 方法
【權(quán)利要求書】:

1.一種甲基化CpG島的高通量測序檢測方法,其特征在于,包括下列步驟:

步驟一、用修飾劑處理DNA樣品,以便將DNA樣品中的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶,而5’甲基胞嘧啶不變,獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段;

步驟二、將所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段用引物A和DNA聚合酶進(jìn)行至少1次線性擴(kuò)增,以便獲得一端能夠錨定接頭引物C的目的片段;

其中所述引物A由3’端和5’端兩部分組成,其中所述3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段,其特征為,長度大于或等于4個(gè)核苷酸且能結(jié)合所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段;

其中所述引物A的5’端部分用于錨定接頭引物C,其特征為,其反向互補(bǔ)序列能夠被接頭引物C結(jié)合并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增;

步驟三、將所述一端能夠錨定接頭引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增,以便獲得富集甲基化CpG島且兩端能夠分別錨定接頭引物C和接頭引物D的目的片段;

其中所述引物B由3’端和5’端兩部分組成,其中所述3’端部分用于結(jié)合所述一端能夠錨定接頭引物C的目的片段并富集性擴(kuò)增甲基化CpG島,其特征為:1)長度大于或等于7個(gè)核苷酸;2)高CpG頻率,其所述高CpG頻率一是指3’端起前7個(gè)核苷酸中包含2個(gè)或3個(gè)CpG;3)高GC含量,其所述高GC含量是指3’端起前10個(gè)核苷酸中C與G之和大于或等于7個(gè),使其退火溫度達(dá)到40度至60度之間;

其中所述引物B的5’端部分用于錨定接頭引物D,其特征為,其反向互補(bǔ)序列能夠被接頭引物D結(jié)合并進(jìn)行PCR擴(kuò)增;

步驟四、將所述富集甲基化CpG島且兩端能夠分別錨定接頭引物C和接頭引物D的目的片段用接頭引物C、接頭引物D和DNA聚合酶進(jìn)行PCR指數(shù)擴(kuò)增,以便獲得擴(kuò)增產(chǎn)物;

步驟五、將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,所述擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成高通量測序文庫;以及,

將所述高通量測序文庫上機(jī)測序及數(shù)據(jù)分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,所述修飾劑為亞硫酸氫鹽。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,所述引物A的3’端部分特征為,除了CpG以外,引物只包含C、A和T;所述引物B的3’端部分特征為,除了CpG以外,引物只包含G、A和T。

4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,所述引物A的3’端第二個(gè)核苷酸為C。

5.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島,其特征為中等CpG頻率,其所述中等CpG頻率是指引物3’端起前7個(gè)核苷酸中包含1個(gè)CpG。

6.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島,其特征為高C頻率,其所述高C頻率是指3’端起前5個(gè)核苷酸中至少包含3個(gè)C。

7.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴(kuò)增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島,其特征為高CpG頻率,其所述高CpG頻率是指3’端起前7個(gè)核苷酸中包含2個(gè)或3個(gè)CpG。

8.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,所述引物B的3’端部分特征為極高CpG頻率,其所述極高CpG頻率是指3’端7個(gè)核苷酸中包含3個(gè)CpG。

9.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,所述步驟二中的DNA聚合酶具有鏈置換功能。

10.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,所述步驟二中的DNA聚合酶是外切核酸酶缺損的。

11.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,所述步驟二進(jìn)行2~30次線性擴(kuò)增。

12.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法,所述步驟三中的DNA聚合酶是熱啟動(dòng)的。

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