[發(fā)明專利]甲基化CpG島的高通量測序檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310259709.9 | 申請日： | 2013-06-27 |
| 公開（公告）號： | CN104250663B | 公開（公告）日： | 2017-09-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 文路;李靜宜;黃巖誼;湯富酬 | 申請（專利權(quán)）人： | 北京大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 100871*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 甲基化 cpg 通量 檢測 方法 | ||
1.一種甲基化CpG島的高通量測序檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：
步驟一、用修飾劑處理DNA樣品，以便將DNA樣品中的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不變，獲得經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段；
步驟二、將所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段用引物A和DNA聚合酶進行至少1次線性擴增，以便獲得一端能夠錨定接頭引物C的目的片段；
其中所述引物A由3’端和5’端兩部分組成，其中所述3’端部分用于結(jié)合和擴增所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段，其特征為，長度大于或等于4個核苷酸且能結(jié)合所述經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段；
其中所述引物A的5’端部分用于錨定接頭引物C，其特征為，其反向互補序列能夠被接頭引物C結(jié)合并進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增；
步驟三、將所述一端能夠錨定接頭引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶進行擴增，以便獲得富集甲基化CpG島且兩端能夠分別錨定接頭引物C和接頭引物D的目的片段；
其中所述引物B由3’端和5’端兩部分組成，其中所述3’端部分用于結(jié)合所述一端能夠錨定接頭引物C的目的片段并富集性擴增甲基化CpG島，其特征為：1)長度大于或等于7個核苷酸；2)高CpG頻率，其所述高CpG頻率一是指3’端起前7個核苷酸中包含2個或3個CpG；3)高GC含量，其所述高GC含量是指3’端起前10個核苷酸中C與G之和大于或等于7個，使其退火溫度達到40度至60度之間；
其中所述引物B的5’端部分用于錨定接頭引物D，其特征為，其反向互補序列能夠被接頭引物D結(jié)合并進行PCR擴增；
步驟四、將所述富集甲基化CpG島且兩端能夠分別錨定接頭引物C和接頭引物D的目的片段用接頭引物C、接頭引物D和DNA聚合酶進行PCR指數(shù)擴增，以便獲得擴增產(chǎn)物；
步驟五、將所述擴增產(chǎn)物進行分離純化，所述擴增產(chǎn)物構(gòu)成高通量測序文庫；以及，
將所述高通量測序文庫上機測序及數(shù)據(jù)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述修飾劑為亞硫酸氫鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述引物A的3’端部分特征為，除了CpG以外，引物只包含C、A和T；所述引物B的3’端部分特征為，除了CpG以外，引物只包含G、A和T。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，所述引物A的3’端第二個核苷酸為C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島，其特征為中等CpG頻率，其所述中等CpG頻率是指引物3’端起前7個核苷酸中包含1個CpG。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島，其特征為高C頻率，其所述高C頻率是指3’端起前5個核苷酸中至少包含3個C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于結(jié)合和擴增經(jīng)過轉(zhuǎn)換的DNA片段并初步富集甲基化CpG島，其特征為高CpG頻率，其所述高CpG頻率是指3’端起前7個核苷酸中包含2個或3個CpG。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，所述引物B的3’端部分特征為極高CpG頻率，其所述極高CpG頻率是指3’端7個核苷酸中包含3個CpG。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，所述步驟二中的DNA聚合酶具有鏈置換功能。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，所述步驟二中的DNA聚合酶是外切核酸酶缺損的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，所述步驟二進行2～30次線性擴增。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的方法，所述步驟三中的DNA聚合酶是熱啟動的。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于北京大學(xué)，未經(jīng)北京大學(xué)許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201310259709.9/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
- CpG-ODN在制備促淋巴瘤細胞凋亡藥物中的應(yīng)用
- 一種濾波器調(diào)度方法及系統(tǒng)
- 一種具有pH響應(yīng)的CpG核酸藥物輸送系統(tǒng)及其制備方法
- 含CpG-ODN基序重組抑制素質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
- 一種CpG藥物及其制備方法和應(yīng)用
- 一種高產(chǎn)CpG ISS工程菌構(gòu)建方法與用途
- 一種基于CPG模型的機器魚閉環(huán)反饋控制方法
- 包括CpG位點的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及測量CpG毗鄰序列影響蛋白解離時間常數(shù)的單分子力學(xué)方法
- 一種對PRRSV具有特異性免疫刺激作用的CpG-ODN及其應(yīng)用
- 一種對PRRSV具有特異性免疫刺激作用的CpG-ODN及其應(yīng)用
