[發(fā)明專利]一種白藜蘆醇半乳糖苷的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310257340.8
• 申請(qǐng)日: 2013-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN103276030A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧麗麗;肖敏;郭玉川
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/44
• 分類號(hào): C12P19/44
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種白藜蘆醇半乳糖苷的制備方法，特別涉及一種利用β-半乳糖苷酶突變酶合成白藜蘆醇半乳糖苷的方法，屬于糖工程技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

白藜蘆醇的化學(xué)名稱為3,5,4’-三羥基二苯乙烯，是非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤、抗炎、保肝、利肝、調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、植物雌激素及防治老年癡呆癥、老年退行性疾病等多種生理功能。白藜蘆醇糖苷類化合物天然存在于多種植物中，也具有重要的生物活性，其中對(duì)心血管的保護(hù)作用、保肝作用、降血脂作用最引人矚目。該類糖苷的獲得目前主要從天然來源提取和化學(xué)法合成，種類有白藜蘆醇葡萄糖苷、白藜蘆醇半乳糖苷、白藜蘆醇乳糖苷、白藜蘆醇麥芽糖苷等。但以上兩種獲得白藜蘆醇的方法均存在局限性：從天然來源中提取所涉及的純化工藝復(fù)雜；化學(xué)合成反應(yīng)步驟繁瑣，需要經(jīng)過多步的基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)過程。

糖苷酶法進(jìn)行糖基化反應(yīng)，底物價(jià)格便宜，步驟簡(jiǎn)單，可以通過一步轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成獲得糖苷產(chǎn)物，但目前尚無糖苷酶法糖基化白藜蘆醇的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種白藜蘆醇半乳糖苷的制備方法。

一種白藜蘆醇半乳糖苷的制備方法，包括如下步驟：

（1）采用磷酸緩沖液配制乳糖濃度為0.1M～0.3M，丙酮配制的白藜蘆醇濃度為0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量為2μg～10μg/mL的反應(yīng)體系；

（2）將步驟（1）制得反應(yīng)體系于37～45℃水浴中反應(yīng)20～60分鐘，煮沸終止反應(yīng)，10000～12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液；

（3）將步驟（2）制得的上清液，經(jīng)分離、干燥后，制得白藜蘆醇半乳糖苷。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1）中氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的β-半乳糖苷酶選用GenBank登錄號(hào)為ACE06986.1，將第980位色氨基酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照發(fā)表文獻(xiàn)[Synthesis?of?galactosyl?sucralose?byβ-galactosidase?from?Lactobacillus?bulgaricus?L3,Food?Chem,2012,134:269-275]所述方法制備酶蛋白，上述β-半乳糖苷酶對(duì)白藜蘆醇具有顯著轉(zhuǎn)糖基活性。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1）中的磷酸緩沖液為濃度10～100mM、pH6～8的磷酸鉀緩沖溶液；根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（1）中的緩沖液為50mM、pH7.0的磷酸鉀緩沖液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2）中的反應(yīng)條件為45℃水浴反應(yīng)45分鐘。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2）中的煮沸終止反應(yīng)條件為100℃煮沸5分鐘。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3）中的分離采用制備型薄層層析板分離，型號(hào)Silica?gel60F254（Merck,Germany）。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3）中的干燥為冷凍干燥。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（3）中還包括分離時(shí)的薄層層析檢測(cè)，合并遷移距離相同的產(chǎn)物的步驟。

上述薄層層析檢測(cè)的步驟如下：

薄層層析板點(diǎn)樣后在展層劑中展開，霧噴顯色劑后，于120℃烘烤5分鐘使糖斑點(diǎn)顯色。

上述展層劑由乙腈和水按體積比85：15混合配制；顯色劑是體積百分比為20%的硫酸和濃度為0.5wt%的3,5-二羥基甲苯的溶液。

有益效果

本發(fā)明以白藜蘆醇為原料，以廉價(jià)乳糖底物為半乳糖基供體，采用經(jīng)過突變的β-半乳糖苷酶一步轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)獲得白藜蘆醇半乳糖苷產(chǎn)物，步驟簡(jiǎn)單，大大降低了白藜蘆醇糖苷的合成成本，且工藝清潔無污染，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為白藜蘆醇半乳糖苷的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

pET-21b(+)質(zhì)粒購自Invitrogen公司；

大腸桿菌BL21(DE3)購自Invitrogen公司。

實(shí)施例1

新型白藜蘆醇半乳糖苷衍生物，其制備步驟如下：

1.β-半乳糖苷酶的制備