[發(fā)明專利]H7N9亞型禽流感病毒快速檢測(cè)引物組及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310254750.7
• 申請(qǐng)日: 2013-06-09
• 公開（公告）號(hào): CN103320532A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金發(fā)光;魯曦;傅恩清;李王平;穆德廣;陳延偉;南巖東;潘蕾;孫瑞琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子診斷和基因診斷領(lǐng)域，為微生物檢測(cè)試劑，試劑檢測(cè)對(duì)象H7N9亞型禽流感病毒RNA。

背景技術(shù)

H7N9型禽流感是一種新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。禽流感病毒屬正粘病毒科甲型流感病毒屬。禽甲型流感病毒顆粒呈多形性，其中球形直徑80～120nm，有囊膜。基因組為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA。依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分為16個(gè)H亞型(H1～H16)和9個(gè)N亞型(N1～N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動(dòng)物。可感染人的禽流感病毒亞型為H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。

此次報(bào)道的人感染H7N9禽流感病毒，是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒，尚未納入我國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静”O(jiān)測(cè)報(bào)告系統(tǒng)。被該病毒感染均在早期出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀，至2013年4月尚未證實(shí)此類病毒是否具有人傳染人的特性。2013年4月經(jīng)調(diào)查，H7N9禽流感病毒基因來自于東亞地區(qū)野鳥和中國(guó)上海、浙江、江蘇雞群的基因重配。

目前，H7N9禽流感病毒感染的診斷，主要根據(jù)流行病學(xué)接觸史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，可以做出人感染H7N9禽流感的診斷。特別是從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)陽性，均可以作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。然而，目前相關(guān)檢測(cè)技術(shù)存在一定程度的弊端：雖然病毒分離屬于診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法只能在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且容易造成對(duì)操作人員直接接觸感染的可能，不利于普及和推廣。此外還有基于PCR技術(shù)的相關(guān)檢測(cè)方法，該技術(shù)具有操作復(fù)雜、檢測(cè)成本較高無形中加重了患者負(fù)擔(dān)、對(duì)于操作人員要求較高、不利于在基層醫(yī)院開展等缺點(diǎn)。此外，根據(jù)PCR技術(shù)的原理，需要有變性、退火、延伸三個(gè)步驟，每個(gè)步驟的反應(yīng)溫度和時(shí)間均不相同且有十分精確的要求，甚至需要進(jìn)行20-40個(gè)循環(huán)來完成，因此需要依賴相對(duì)貴重的PCR溫度循環(huán)儀進(jìn)行控制，不利于現(xiàn)場(chǎng)診斷的要求。核酸序列擴(kuò)增法(NASBA)，自序列復(fù)制法(3SR)和鏈置換復(fù)制法(SDA)雖然屬于等溫?cái)U(kuò)增法，它們對(duì)目標(biāo)序列的擴(kuò)增特異性不強(qiáng)，使得擴(kuò)增后還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作手段來對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，因此具有操作繁瑣的缺點(diǎn)。在病原體集中爆發(fā)期間，由于單克隆抗體獲得周期較長(zhǎng)，不利于在疾病爆發(fā)期間進(jìn)行檢測(cè)。

為了改善目前H7N9檢測(cè)操作復(fù)雜、依賴昂貴的儀器設(shè)備、檢測(cè)成本高、對(duì)操作人員要求較高等缺點(diǎn)，開發(fā)一種能夠不依賴于昂貴的儀器設(shè)備，能夠在1小時(shí)內(nèi)對(duì)患者樣本進(jìn)行檢測(cè)，并且可以用肉眼直接觀察結(jié)果的H7N9檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢準(zhǔn)率高特點(diǎn)，使其反應(yīng)程序化，能夠廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)及流行病學(xué)調(diào)查。

DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated?Isothermal?Amplification?of?DNA，簡(jiǎn)稱LAMP)克服以往基因擴(kuò)增方法的不足，在恒溫條件下能夠特異性、高效、快速地進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，具有很多的優(yōu)越性(見文獻(xiàn)Notomi?T，Okayama?H，Masubuchi?H，Yonekawa?T，Watanabe?K，Amino?N，Hase?T.Loop-mediated?isothermal?amplification?ofDNA，Nucleic?Acids?Res.2000Jun15；28(12)：E63.)。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)僅需要一對(duì)引物來識(shí)別靶DNA，達(dá)到分子檢測(cè)的目的，而LAMP技術(shù)使用2對(duì)引物，一共識(shí)別靶DNA的6個(gè)不同區(qū)域，因此特異性較高；(2)靈敏度高，由于該技術(shù)使用了一種靈敏度、擴(kuò)增效率高的DNA聚合酶，因此大大提高了靈敏度，并且縮短了檢測(cè)時(shí)間；(3)操作簡(jiǎn)單，是用肉眼對(duì)結(jié)果就能進(jìn)行判斷，并且在等溫條件下反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便不依賴貴重儀器設(shè)備。

因此本發(fā)明利用了該技術(shù)的上述優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于H7N9禽流感病毒的檢測(cè)，能夠改善目前眾多技術(shù)的不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了高效、特異性檢測(cè)H7N9禽流感病毒的目的。

本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案如下：

一組用于檢測(cè)H7N9亞型禽流感病毒的引物組，其包含以下引物：

(1)針對(duì)H7亞型進(jìn)行檢測(cè)的各引物如下：

外引物1：GAAGAAGCTCTGAGGCAA

外引物2：CTTAGTCATCTGCGGGAA

內(nèi)引物1：

TGCTCCATTAGTTCTTATTCCACTGATTCTCAGAGAATCAGGCG