[發明專利]脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用

有效

• 申請號: 201310254150.0
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN103383397A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 岳田利;王周利;袁亞宏;蔡瑞;牛晨;郭彩霞
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;A23L3/3526
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 史玫

技術領域

本發明屬于食品微生物檢測技術領域，具體涉及脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用。

背景技術

脂環酸芽孢桿菌，俗稱嗜酸耐熱菌，屬于革蘭氏陽性芽孢桿菌，桿狀、產芽孢、嚴格需氧，可以在pH2.5～6.0，20～60℃廣泛溫度范圍內存活和生長，是蘋果及其他果汁中常見的污染菌。由于其具有耐熱、耐酸的特性，普通的巴氏殺菌難以將其殺滅。該菌在濃縮果汁中不繁殖，但濃縮果汁稀釋成低濃度果汁時，即可代謝產生具有不愉快風味的物質——愈創木酚和2,6-二溴苯酚，使果汁口感、風味變差，形成白色沉淀或霧狀渾濁，使蘋果汁品質下降。因此，濃縮蘋果汁中脂環酸芽孢桿菌的快速檢測及控制技術已成為食品工業研究的熱點。

目前，對于蘋果汁中脂環酸芽孢桿菌的控制技術，研究較多的有高溫殺滅，歐姆加熱法，脈沖電場殺菌，紫外線照射，輻照，超聲波及超高壓殺滅等。在濃縮蘋果汁工業化生產過程中對于脂環酸芽孢桿菌的控制，主要是高溫瞬時滅菌和膜過濾。高溫處理會對果汁的風味產生一定的影響，而膜過濾方法由于成本高，且使用一定時間后過濾效果下降，需要根據過濾效果周期性的更換濾膜，導致了生產成本的增加。

發明內容

本發明的目的之一是提供脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球，以實現食品中脂環酸芽孢桿菌的快速分離。

為此，本發明提供的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體而得到的；所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的制備方法包括：利用含過硫酸鈉的PBS緩沖液對脂環酸芽孢桿菌特異性抗體進行氧化處理，之后收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。

采用Sephadex?G-25層析柱收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。

所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體制備方法還包括：

所述含過硫酸鈉的PBS緩沖液中過硫酸鈉濃度為10mg/mL，PBS緩沖液的濃度為0.1mol/L、pH值為7.4；

所述脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為（1-3mg）/mL；所述含過硫酸鈉的PBS緩沖液與脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的體積比為（1-3）：1。

所述胺基化磁性微球的制備方法包括：

（1）80-90℃條件下，Fe₃O₄磁核在硅酸鈉溶液中進行硅烷化反應制備硅烷化磁性微球；所述硅酸鈉溶液的質量濃度為4%-5%、PH大于11；

（2）調節硅烷化磁性微球的PH呈中性；

（3）80-90℃條件下，將PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去離子水和甘油混合反應制備胺基化磁性微球；所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去離子水和甘油的用量為：

硅烷化磁性微球：????????????（1-2g）/毫升

甲醇：???????????????????????150體積，

3-氨丙基三乙氧基硅烷：???????10體積，

去離子水：???????????????????1體積，

甘油：???????????????????????150-161體積。

所述的Fe₃O₄磁核的粒徑為15-25nm、磁性的飽和磁化強度為在（40-80emu）/g。

所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為（1-2mg）/毫升，且每毫升氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體用20mg的胺基化磁性微球包被。

進一步地，利用封閉液封閉所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球，所述封閉液的組分量為：每100ml?PBS中含有1-10克BSA和0.05ml?Tween-20。

本發明提供脂環酸芽孢桿菌的免疫磁微球優點在于：

（1）本發明中的胺基化磁性微球具有特異性結合位點，可以實現對抗體的高效及特異性固定化，有效保留了抗體-抗原反應結合位點。

（2）本發明的脂環酸芽孢桿菌特異性抗體氧化處理方法中抗體的Fc區域的糖鏈羥基部分被氧化為醛基，且保留了抗體的識別位點；處理后的抗體可與磁性微球的胺基部分高效結合，并保留了抗體的Fab活性區域，保證對目標菌體的有效識別和分離。

（3）本發明的制備方法中抗體有效結合到磁性微球表面，并保留了對脂環酸芽孢桿菌高度特異性分離和富集特性。尤其是經封閉處理后的免疫磁性微球可實現脂環酸芽孢桿菌的有效分離。