[發明專利]一種雙組份植物激素的同時測定方法

有效

• 申請號: 201310253926.7
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103323607A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 混旭;陳壞成
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/531;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種雙組份植物激素同時測定的方法，植物激素為IAA和GA的雙組份，其特征在于用金納米粒子和氨基化磁珠為載體，以ABEI-BSAAuNPs為納米粒子標記物，實現植物激素IAA和GA的雙組份同時測定，測定步驟如下：

（1）金納米粒子AuNPs的制備，制備、儲存金納米粒子溶液所用的玻璃容器用王水泡洗30?min，然后用二次蒸餾水沖洗干凈，烘干備用；在250?mL圓底燒瓶中加入100?mL質量濃度0.01%的HAuCl₄，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入1.8?mL質量濃度1%的Na₃C₆H₅O₇，繼續加熱10?min，攪15?min，冷卻至室溫，轉移到棕色瓶中于陰涼處保存；

（2）anti-IAA抗體標記金納米粒子的制備，取2?mL的樣品管，依次加入pH為8.2的2?μL?500?mM的Tris-HCl，6?μL10?mM的TCEP，6?μL?10^-4?M的巰基乙胺，室溫放置30?min后加入1?mL?步驟（1）制備的AuNPs，室溫下反應12?h，得巰基乙胺修飾金納米粒子；取上述所得的巰基乙胺修飾金納米粒子分散在含5（wt）%戊二醛的磷酸緩沖溶液中，持續攪拌2?h，用磷酸緩沖溶液離心清洗3次，再將其在磷酸緩沖溶液中，加入含10?μg?anti-IAA抗體溶液，4?℃振動孵育12?h，得到anti-IAA抗體標記金納米粒子；

（3）anti-GA抗體標記磁珠的制備，在2?mL的樣品管中加入含10?μg?anti-GA抗體溶液，再加入1000?μL?含0.1?M的EDC和0.2?M的NHS，活化30?min，另取一個10?mL的小燒杯，加入50?μL粒徑為2～3?μm氨基化磁珠，2000?μL?0.1M，pH為6.8咪唑緩沖液，活化30?min；將上述兩溶液混合反應12?h，磁性分離，棄上清液，再用磷酸緩沖溶液洗三次，用磷酸緩沖溶液定容至500?μL，得到anti-GA抗體標記磁珠；

（4）抗體標記ABEI-BSAAuNPs的制備

a.?BSAAuNPs納米粒子的制備，將5?mL經過恒溫的HAuCl₄溶液加入到5?mL濃度為?50?mg/mL的BSA溶液中，攪拌反應2?min，然后加入0.5?mL?1?M?NaOH，并在37?℃下繼續反應1小時，得BSAAuNPs納米粒子，粒徑為2-3?nm，室溫下保存；

b.?ABEI-BSAAuNPs的制備，在pH為7.4的PBS緩沖溶液加入1?mL?BSAAuNPs，再加入NHS?10?mg、EDC?20mg，將該混合液在37?℃下攪拌1小時，然后加入1?mL?N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾溶液，在室溫下攪拌12-18小時，得到ABEI-BSAAuNPs復合物；

c.?抗體標記ABEI-BSAAuNPs的制備，取1?mL?ABEI-BSAAuNPs溶液，加入NHS?3.6?mg、EDC?7.2?mg，在37?℃下活化1小時，再加入100?μL的ABEI-BSAAuNPs，反應時間12-18小時；再將其分成兩份，一份加入含10?μg?anti-IAA抗體溶液，4?℃振動孵育1?h，得到IAA抗體標記ABEI-BSAAuNPs；另外一份10?μg?anti-GA抗體溶液，4?℃振動孵育12?h，得到GA抗體標記ABEI-BSAAuNPs；

（5）雙組分植物激素的檢測，將不同量的目標物IAA和GA標準溶液分別混合，加入anti-GA抗體標記磁珠和anti-IAA抗體標記金納米粒子，37?℃孵育1?h，離心分離，離心機轉速為14000?rpm，分離后用PBST溶液清洗3次，再加入GA抗體標記ABEI-BSAAuNPs和IAA抗體標記ABEI-BSAAuNPs混合溶液，37?℃孵育1?h；隨后，用包含有2%?BSA的WB洗滌液洗滌3次，分成2等份，一份在磁性分離器下吸棄上清液，下層溶液用磷酸緩沖溶液洗滌3次，然后進行化學發光測定，根據化學發光信號對GA進行定量；另外一份，在磁性分離器下吸取上清液，將所得上清液在13000?rpm轉速下離心，收集沉淀，并用磷酸緩沖溶液洗滌3次，然后進行化學發光測定，根據化學發光信號對IAA進行定量，根據標準溶液濃度和信號關系作圖得標準曲線；

（6）樣品分析，將微納米級微透析探針插入模式植物內部，對植物激素進行微透析無損傷原位、實時取樣，在通道下游待測組分按步驟（5）方法進行實驗，根據化學發光信號和步驟（5）所得標準曲線可以獲取植物激素IAA和GA含量。