[發(fā)明專利]重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310253850.8
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN104232710B
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉仲健;李利強(qiáng);肖新菊;張麗君;羅煥亮;梁楠楠
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/22;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 張全文

本發(fā)明提供了一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用。上述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，通過使用親和層析法將重組菌表達(dá)的可溶性植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行提純，尤其是將包涵體裂解，結(jié)合利用透析法和親和層析法對包涵體中的不溶性植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白進(jìn)行提純，并通過對提純的條件和工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而大大提高重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化效果，提純度可達(dá)95%，而傳統(tǒng)方法的提純度為60%。該方法工藝簡單、易于操作，并且產(chǎn)出量高、降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植原體(phytoplasma)是一類GC含量比較低，無細(xì)胞壁，僅有3層單位膜包被的原核微生物，專性寄生于植物和昆蟲。植物染病主要癥狀包括叢枝、黃化、花變?nèi)~、花器退化等，由于植原體侵染性強(qiáng)，危害寄主廣泛，曾造成許多經(jīng)濟(jì)作物、林木的大量死亡，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于植原體為無細(xì)胞壁原核微生物，尚不能在人工培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，給分類鑒定、傳播機(jī)制、致病機(jī)制的研究帶來許多困難。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是最終遺傳信息功能的實(shí)施者，而且植原體缺乏細(xì)胞壁，其膜蛋白可以直接與植物的細(xì)胞質(zhì)或介體昆蟲的細(xì)胞接觸，在寄主和病原的相互作用中起著重要作用。因此研究植原體膜蛋白對于建立植原體血清學(xué)檢測方法，揭示植原體的進(jìn)化、致病性及其與寄主的相互作用具有重要意義。

而免疫主導(dǎo)膜蛋白(immunodominant membrane proteins，IDPs)是大多數(shù)植原體總細(xì)胞膜蛋白的主要部分。將各組植原體的免疫膜蛋白IDPs分成三種類型：(1)免疫主導(dǎo)膜蛋白(immunodominant membrane protein，Imp)，代表性植原體有SPWB、AP、ESFY、PD和PYLR；(2)免疫主導(dǎo)膜蛋白A(immunodominant membrane protein A，IdpA)，代表性植原體是WX；(3)免疫抗原膜蛋白(antigenic membrane protein，Amp)，代表性植原體是AY和CP。1999年Michael Berg等從蘋果叢枝植原體中分離出免疫主導(dǎo)膜蛋白(immunodominantmembrane protein，Imp)，并外源表達(dá)基因不同片段產(chǎn)物。研究中Berg等人分別在長春花和煙草染病植株中檢測到了分子量大約為19KDa大小相似的蛋白，序列分析表明該類蛋白具有整合膜蛋白的特征，其N端暴露在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，一個疏水跨膜片段形成α螺旋錨定在膜中，親水的C端暴露在細(xì)胞外。2004年，Kakizawa等人克隆了植原體Sec(細(xì)胞分泌)系統(tǒng)蛋白A、E、Y，且研究發(fā)現(xiàn)SecA有較強(qiáng)的免疫原性，其抗血清能檢測多種植原體。但是由于不同植原體膜蛋白特異性的差異，有些膜蛋白能夠在大腸桿菌體系內(nèi)完整表達(dá)，有些則表達(dá)困難，且易形成包涵體，另一方面即使膜蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，但由于膜蛋白的疏水性、溶解度等性質(zhì)為后續(xù)下游分離純化膜蛋白造成了困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種有效提高重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白純化度的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：

獲得表達(dá)植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)；

破碎經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌，分離得到上清液一和沉淀物一；

將上述上清液一加入至樹脂懸液與結(jié)合緩沖液混合液中，所述樹脂懸液與所述結(jié)合緩沖液的體積比為1～4：1～5，在4～8℃的溫度下振蕩1～2小時后靜置沉降，然后依次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液；