[發明專利]重組植原體免疫主導膜蛋白的純化方法及其應用

有效

• 申請號: 201310253850.8
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN104232710B
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 劉仲健;李利強;肖新菊;張麗君;羅煥亮;梁楠楠
• 申請（專利權）人: 深圳市蘭科植物保護研究中心
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/22;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

本發明提供了一種重組植原體免疫主導膜蛋白的純化方法及其應用。上述重組植原體免疫主導膜蛋白的純化方法，通過使用親和層析法將重組菌表達的可溶性植原體免疫主導膜蛋白進行提純，尤其是將包涵體裂解，結合利用透析法和親和層析法對包涵體中的不溶性植原體免疫主導膜蛋白進行提純，并通過對提純的條件和工藝參數進行優化，從而大大提高重組植原體免疫主導膜蛋白的純化效果，提純度可達95%，而傳統方法的提純度為60%。該方法工藝簡單、易于操作，并且產出量高、降低了生產成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組植原體免疫主導膜蛋白的純化方法及其應用。

背景技術

植原體(phytoplasma)是一類GC含量比較低，無細胞壁，僅有3層單位膜包被的原核微生物，專性寄生于植物和昆蟲。植物染病主要癥狀包括叢枝、黃化、花變葉、花器退化等，由于植原體侵染性強，危害寄主廣泛，曾造成許多經濟作物、林木的大量死亡，帶來嚴重的經濟損失。由于植原體為無細胞壁原核微生物，尚不能在人工培養基上離體培養，給分類鑒定、傳播機制、致病機制的研究帶來許多困難。因為蛋白質是最終遺傳信息功能的實施者，而且植原體缺乏細胞壁，其膜蛋白可以直接與植物的細胞質或介體昆蟲的細胞接觸，在寄主和病原的相互作用中起著重要作用。因此研究植原體膜蛋白對于建立植原體血清學檢測方法，揭示植原體的進化、致病性及其與寄主的相互作用具有重要意義。

而免疫主導膜蛋白(immunodominant membrane proteins，IDPs)是大多數植原體總細胞膜蛋白的主要部分。將各組植原體的免疫膜蛋白IDPs分成三種類型：(1)免疫主導膜蛋白(immunodominant membrane protein，Imp)，代表性植原體有SPWB、AP、ESFY、PD和PYLR；(2)免疫主導膜蛋白A(immunodominant membrane protein A，IdpA)，代表性植原體是WX；(3)免疫抗原膜蛋白(antigenic membrane protein，Amp)，代表性植原體是AY和CP。1999年Michael Berg等從蘋果叢枝植原體中分離出免疫主導膜蛋白(immunodominantmembrane protein，Imp)，并外源表達基因不同片段產物。研究中Berg等人分別在長春花和煙草染病植株中檢測到了分子量大約為19KDa大小相似的蛋白，序列分析表明該類蛋白具有整合膜蛋白的特征，其N端暴露在細胞質一側，一個疏水跨膜片段形成α螺旋錨定在膜中，親水的C端暴露在細胞外。2004年，Kakizawa等人克隆了植原體Sec(細胞分泌)系統蛋白A、E、Y，且研究發現SecA有較強的免疫原性，其抗血清能檢測多種植原體。但是由于不同植原體膜蛋白特異性的差異，有些膜蛋白能夠在大腸桿菌體系內完整表達，有些則表達困難，且易形成包涵體，另一方面即使膜蛋白在大腸桿菌系統進行了表達，但由于膜蛋白的疏水性、溶解度等性質為后續下游分離純化膜蛋白造成了困難。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種有效提高重組植原體免疫主導膜蛋白純化度的方法。

本發明的另一目的在于提供一種重組植原體免疫主導膜蛋白的應用。

為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：

獲得表達植原體免疫主導膜蛋白的重組菌，誘導表達；

破碎經誘導表達后的重組菌，分離得到上清液一和沉淀物一；

將上述上清液一加入至樹脂懸液與結合緩沖液混合液中，所述樹脂懸液與所述結合緩沖液的體積比為1～4：1～5，在4～8℃的溫度下振蕩1～2小時后靜置沉降，然后依次經漂洗、洗脫處理，得到可溶性重組植原體免疫主導膜蛋白溶液；