[發(fā)明專利]重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310253850.8
• 申請日: 2013-06-24
• 公開（公告）號: CN104232710B
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉仲健;李利強;肖新菊;張麗君;羅煥亮;梁楠楠
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市蘭科植物保護研究中心
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/22;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務(wù)所 44237
• 代理人: 張全文

1.一種重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，包括如下步驟：

獲得表達植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌，誘導(dǎo)表達；

破碎經(jīng)誘導(dǎo)表達后的重組菌，分離得到上清液一和沉淀物一；

將所述上清液一加入至樹脂懸液與結(jié)合緩沖液混合液中，所述樹脂懸液與所述結(jié)合緩沖液的體積比為1~4：1~5，在4~8℃的溫度下振蕩1~2小時后靜置沉降，然后依次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液；

將所述沉淀物一懸重洗滌后并經(jīng)孵育處理，得到所述沉淀物一的溶解液；將所述沉淀物一的溶解液加入至所述樹脂懸液與所述結(jié)合緩沖液混合液中，所述樹脂懸液與所述結(jié)合緩沖液的體積比為1~4：1~5，在4~8℃的溫度下振蕩1~2小時后靜置沉降，然后依次經(jīng)漂洗、洗脫處理，得到包涵體重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的溶液，其中，所述沉淀物一洗滌步驟使用包涵體洗滌緩沖液，所述洗滌緩沖液包含50~60mmol/L Tris-HCl，90~100mmol/L NaCl，0.5~1mmol/L 乙二胺四乙酸，7~8 mmol/L聚乙二醇辛基苯基醚，pH8.0~8.2；

將所述可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液與所述包涵體中重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的溶液進行透析濃縮，得到所述重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白；

所述樹脂懸液為50%的Ni-NTA-His?Bind樹脂懸液；所述結(jié)合緩沖液為Ni-NTA結(jié)合緩沖液，所述Ni-NTA結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度為0~10 mM/L，pH值為7~8。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述漂洗步驟使用Ni-NTA漂洗緩沖液，所述Ni-NTA漂洗緩沖液中的咪唑濃度為20~60 mM/L，pH值為7~8；所述洗脫步驟使用Ni-NTA洗脫緩沖液，所述Ni-NTA洗脫緩沖液中的咪唑濃度為200~300 mM/L，pH值為7~8。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述淀物一經(jīng)洗滌后用包涵體溶解緩沖液重懸，所述包涵體溶解緩沖液包含500~600mmol/L的3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸鹽、10~15mmol/L 的N-十二烷基肌氨酸鈉和0.8~1mmol/L的二硫蘇糖醇，pH值為10~11。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述透析步驟為將所述可溶性重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白溶液和包涵體中重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的溶液加入至透析液中，在4~8℃的溫度下透析3~4小時；所述透析緩沖液包含0.01~0.02mol/L的 Tris-HCl、0.05~0.1mmol/L的二硫蘇糖醇，pH值為8.2~8.5。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述破碎經(jīng)誘導(dǎo)表達后的重組菌的方法為直接破碎或復(fù)合破碎；其中，所述復(fù)合破碎的方法為：將所述經(jīng)誘導(dǎo)表達后的重組菌在-4~-20℃的溫度下凍融2~4次，加入抽提試劑，在20~25℃的溫度下重懸，振蕩孵育30~60分鐘；其中所述抽提試劑體積與所述經(jīng)誘導(dǎo)表達后的重組菌的質(zhì)量比為5~10ml/g。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述獲得表達植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌的方法如下：

合成含有6× His Tag序列的植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因，設(shè)計引物對，擴增所述植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因；

將所述植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白基因克隆至表達質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；

用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，得到表達植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的重組菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白的純化方法，其特征在于，所述引物對為引物對一、引物對二、引物對三中的任一種；其中，所述引物對一包含上游引物 F'5'-ACCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物R'5'-CGCTCGAGCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所述引物對二包含上游引物F'5'-CGCCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物R'5'-CCCCTCGAGCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'，所述引物對三包含上游引物F'5'-GGGTTTCATATGGAAGGTAAGCAGCAAATAACGA-3'和下游引物R'5'-CCCTCGAGCTCCATCACCAGTGCGGTCTCAATC-3'。