[發明專利]一種化學酶法合成生物素中間體內酯的方法

有效

• 申請號: 201310251591.5
• 申請日: 2013-06-21
• 公開（公告）號: CN103409478A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 汪釗;鄭建永;朱勇剛;王升帆
• 申請（專利權）人: 浙江圣達藥業有限公司;浙江工業大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種化學酶法合成生物素中間體內酯（(3aS，6aR)-1，3-二芐基-四氫-4H-呋喃并[3，4-d]咪唑-2，4(1H-)-二酮）的方法。?

（二）背景技術

生物素（vitamin?H或vitamin?B7）[CAS:58-85-5]是一種重要的水溶性B簇維生素，廣泛應用于醫療、多維制劑及飼料添加劑方面，尤其是配制飼料的關鍵組分之一。我國是飼料需求大戶，近年來飼料工業發展迅速，對生物素的需求也越來越大。光學純的右旋生物素中間體內酯是生產d-生物素的重要中間體。生產d-生物素的主要技術是中間體內酯的手性合成技術。目前國內產家一直采用化學法拆分，如陳芬兒等采用化學晶析法拆分，其工藝復雜，且拆分不完全，造成原料浪費，成本較高。經化學拆分后得到內酯右旋體和左旋體的混旋物，該混旋物無法利用只能作為廢棄物處理，造成了原料的極大浪費和環境污染。?

因此，對當前生物素中間體內酯的合成技術改進開發研究，尋找一條適宜的綠色化學工藝路線，有著極其重要的經濟價值和現實意義。利用生物酶法不對稱合成生物素中間體單酯再進一步合成得到光學純的內酯右旋體，不僅可以大大降低d-生物素的生產降低成本，而且環境友好，具有顯著效果，符合綠色、環保的可持續發展戰略，具有良好的社會經濟效益，發展前景廣闊。?

（三）發明內容

本發明的目的是為了解決上述方法的不足，提供了一種以生物素中間?體Ⅰ為反應底物，在脂肪酶的作用下不對稱酯交換反應得到生物素中間體Ⅱ，然后經氧化、去乙酰化、閉環等合成生物素內酯Ⅲ的方法。?

本發明采用的技術方案是：?

一種化學酶法合成式（Ⅲ）所示生物素中間體內酯的方法，所述方法包括：以式（Ⅰ）所示生物素中間體二醇為反應底物，在有機溶劑中，加入?；w，在脂肪酶的作用下，于10～50℃下進行酯交換不對稱合成反應3～60小時，制得式（Ⅱ）所示生物素中間體單酯，再經過氧化、去乙?；?、閉環得到式（Ⅲ）所示生物素中間體內酯；所述?；w為下列之一：乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、乙酸、乙酸酐、乙酸異丙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯；所述有機溶劑為下列之一或其中兩種以上的混合物：1,4-二氧六環、乙腈、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、甲苯、環己烷、正己烷；所述脂肪酶為本領域熟知的屬于EC3.1.1.3類酶的那些酶；?

本發明涉及的反應式如下：?

優選的，所述脂肪酶為下列之一：Lipozyme?TL?IM、Lipozyme?RM?IM、Lipase?PS?IM、Novozym435，上述均為市購脂肪酶。?

優選的，所述酰基供體為乙酸乙烯酯或丁酸乙烯酯，更優選為乙酸乙烯酯。?

優選的，所述有機溶劑為1,4-二氧六環、甲苯、或其混合物，更優選?為1,4-二氧六環和甲苯體積比1:3的混合物。?

優選的，有機溶劑中底物初始濃度為1～200g/L，酰基供體添加濃度為1～50%，脂肪酶加入量為0.1～25U/g底物。U為1個酶活力單位，所述的1個酶活力單位是在規定的條件下測定的每分鐘催化合成生物素中間體單酯Ⅱ的1μmol量的脂肪酶的量，所述的規定條件為：取0.01g酶粉，加入0.2g生物素中間體Ⅰ的二氧六環和甲苯（體積比1:3）的混合溶液10ml，加入0.1ml乙酸乙烯酯，35℃條件下攪拌轉速200rpm，反應6h后，過濾除去酶粉，取反應液用液相色譜分析測定轉化得到的生物素中間體Ⅱ摩爾量以及ee值。?

優選的，所述酯交換不對稱合成反應在30～50℃下進行，反應時間6～12小時。?

生物素中間體Ⅰ和生物素中間體Ⅱ的液相色譜儀測定條件：chiralAD-H柱；柱溫箱溫度恒溫25℃；流動相：正己烷：異丙醇=8:2；流速：0.8ml/min；UV檢測器；檢測波長210nm。?

生物素中間體單酯Ⅱ的純化：酶轉化后過濾除去脂肪酶，通過旋轉蒸發儀除去有機溶劑得到產物生物素中間體單酯Ⅱ；?

生物素中間體內酯Ⅲ的合成：生物素中間體單酯Ⅱ溶于丙酮，然后經過氧化，去乙?；]環得到生物素中間體內酯Ⅲ產品。?

本發明所述生物素中間體內酯Ⅲ的制備方法的有益效果主要體現在：酶的立體選擇性強，反應轉化率高，下游分離簡單，能耗低，環境污染小，適合工業化生產。?

（四）具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此：?

實施例1：?