[發明專利]一種可同時檢測多個HBV耐藥突變位點的新方法

有效

• 申請號: 201310249437.4
• 申請日: 2013-06-22
• 公開（公告）號: CN103320531A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 歐啟水;劉燦;商紅艷;曾勇彬;陳添彬
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種COLD-PCR聯合測序技術，屬于基因突變檢測領域。?

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)由于轉錄過程中由于缺乏嚴格的校正機制，核苷酸錯配率高，在抗病毒藥核苷(酸)類似物(nucleot(s)ide?analogues,?NA)的壓力選擇下，HBV逆轉錄酶區(reverse?transcriptase,?rt)易發生突變，即基因型耐藥突變，并導致對抗病毒藥物耐藥。為提高HBV的治療效果，更好地監測及減少耐藥的發生，在用藥過程中有必要監測慢性乙型肝炎（CHB）患者rt區是否存在突變。

????檢測HBV基因突變的方法主要有測序法、反向雜交法(reverse?hybridization?assay)?、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)、實時熒光定量PCR?(real-time?PCR)、限制性片段質譜多態性技術(restriction?fragment?mass?polymorphism，RFMP)、超深度焦磷酸測序(Ultradeep?Pyrosequencing,?UDPS)、?基因芯片(gene?chip)等。PCR直接測序法(sanger測序法)因其可一次性檢測多個位點、可同時檢測已知和可能的未知耐藥變異位點、假陽性率低等優點被認為基因型耐藥檢測的金標準，但其靈敏性較差，只有當變異株超過HBV準種池20%時才能被發現，容易出現假陰性結果；反向雜交的靈敏度較高，約為5％，但其價格較貴，操作不夠簡便，尤其在發展中國家無法全面推廣；PCR-RFLP及real-time?PCR只能檢測已知、單一位點的變異，隨著多種核苷(酸)類似物的相繼問世和HBV新的耐藥變異位點的不斷出現，這些方法將難以勝任；一些新的技術，如RFMP、UDPS和gene?chip等技術逐漸得以應用，但是這些技術存在價格昂貴、操作繁瑣、數據分析工作量大、存在堿基錯配等缺點，較適合于研究目的，不太適合于臨床應用。因此，探索建立實用、靈敏度高的耐藥突變檢測方法十分必要。

低變性溫度共擴增PCR(coamplification?at?lower?denaturation?temperature?PCR，COLD-PCR)是2008年最先由Li(Li?J,?Wang?LL,?Mamon?H,?et?al.?Replacing?PCR?with?COLD-PCR?enriches?variant?DNA?sequences?and?redefines?the?sensitivity?of?genetic?testing.?Nat?Med?2008;14:579-584.)等報道的可提高sanger測序法靈敏度的一種PCR方法，其基于存在錯配堿基的雙鏈DNA熔解溫度會發生改變的原理而建立的。根據突變后堿基是否使Tm溫度下降可分為快速COLD-PCR(fast?COLD-PCR)和完全COLD-PCR?(full?COLD-PCR)。由于COLD-PCR技術不需要昂貴的設備，僅通過體系條件的優化就可提高對突變株的檢測靈敏度，其已廣泛應用于腫瘤相關基因的突變檢測，如p53、EGFR、k-ras、MPL等基因的檢測，但未見用于檢測HBV基因突變的報道。?

發明內容

為了克服上述檢測HBV基因突變方法的缺點，本發明率先建立了高度靈敏、簡便、價廉和實用的COLD-PCR法聯合sanger測序技術，探討將其應用于HBV的已知和未知耐藥突變檢測的可行性。

????本發明提供的技術方案為：

一種可同時檢測多個乙型肝炎病毒耐藥突變位點的檢測方法，步驟為：

1）????????????設計和合成一對引物，如SEQ?ID?No.1-2所示；

2）????????????以乙型肝炎病毒DNA為模版，并以步驟1所述的一對引物為擴增引物進行擴增，測定擴增產物的熔解溫度Tm；依據熔解溫度Tm，通過改變擴增變性溫度確定關鍵變性溫度Tc；

3）????????????通過Tc建立COLD-PCR反應體系條件并反應得到COLD-PCR產物；

4）????????????將COLD-PCR產物進行sanger雙向序列測定。

所述的COLD-PCR包括以下兩種方式：fast?COLD-PCR和full?COLD-PCR。

fast?COLD-PCR的反應條件為：

95℃預變性30s；95℃變性10s，56℃退火延伸30s，5個循環；Tc℃變性20s，56℃退火延伸30s，35個循環。