[發明專利]制備分子量可控的藥用右旋糖酐的方法

有效

• 申請號: 201310247228.6
• 申請日: 2013-06-21
• 公開（公告）號: CN103290080A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 張洪斌;曹妍妍;張宇琪;宋丹丹;胡雪芹
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P19/16;C12P19/08;C12R1/01
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技術領域

本發明屬于生物制藥與酶工程領域，特別涉及一種發酵法結合酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐的方法。

技術背景

右旋糖酐(dextran)又名葡聚糖，是蔗糖經腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc?mesenteroides)產生的右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase?EC2.4.1.5)催化合成的高分子葡萄糖聚合物，該聚合物含有95％的α-1，6糖苷鍵，同時含有少量其他糖苷鍵的分支結構。因其具有安全、無毒等多種優點，已被廣泛應用于醫藥、食品和工業等多個領域。高分子右旋糖酐可以用作藥物載體，以及常用的凝膠色譜填料。臨床上常用的右旋糖酐有三種規格：右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，它們主要用作血漿代用品，用于出血性休克、創傷性休克及燒傷性休克等。重均分子量6-8kDa的右旋糖酐常被制成右旋糖酐鐵，用于治療嚴重的貧血癥。重均分子量5kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用于治療血栓。低分子異麥芽糖近來被發現，可用作益生元。作為一種來源豐富的多糖，右旋糖酐是食品工業中的優良配料，主要用作保濕劑、穩定劑、增量及和增稠劑。在工業上，右旋糖酐被用作為油井鉆泥的添加劑。

目前國內主要采用發酵法制備高分子右旋糖酐，再利用鹽酸水解得到不同分子量的右旋糖酐。在藥用右旋糖酐的生產過程中，由于酸水解工藝引入大量氯化物，嚴重影響右旋糖酐的品質，在臨床使用中出現過敏反應，可引起皮膚過敏、呼吸和循環系統衰竭，甚至導致死亡。在高溫、強酸的水解條件，水解過程無序、難以操作，得到的右旋糖酐分子量不集中，影響產品質量和產率。另外，高溫、強酸的水解條件，也不利于環保。采用發酵法結合酶法制備藥用右旋糖酐，不僅能避免氯化物對產品質量的影響，同時由于右旋糖酐酶對底物的特異性水解，能得到分子量集中的高品質右旋糖酐，提高產率。此外，酶催化水解反應條件溫和、能耗低，實現了中、小分子量多糖生產工藝的綠色、環保、低碳的目標。目前國內外已有學者直接采用分別產右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的菌株發酵制備藥用右旋糖酐，但是由于直接發酵，菌株產生的代謝物種類繁雜，不利于產品的分離純化，同時由于產率低，不利于產業化生產。另外也有學者采用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶雙酶聯合制備藥用右旋糖酐，但是由于右旋糖酐蔗糖酶成本高，從而不利于產業化生產。

發明內容

本發明為了解決現有技術存在的不足之處，提供一種采用發酵法結合酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐的方法，該方法不僅綠色、環保、低成本、簡便易操作；而且可實現右旋糖酐的分子量可控性生產。

本發明解決技術問題采用如下方案：

發酵法結合酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐，按如下步驟進行：

(1)腸膜狀明串珠菌發酵合成高分子右旋糖酐

向發酵培養基中加入發酵培養基體積5％的腸膜狀明串珠菌種子液，在25度，pH值為7.2～7.6，搖床轉速為120r/min條件下，發酵22小時后，從發酵液中分離高分子右旋糖酐。

其中，所述的腸膜狀明串珠菌種子液是工業上常用的腸膜狀明串珠菌(L.M-1226號菌)種子液，優選處于菌體生長指數期的腸膜狀明串珠菌種子液。該腸膜狀明串株菌的培養基是本領域工業上用于培養腸膜狀明串珠菌的培養基，種子液培養基是：蔗糖15％，蛋白胨0.25％，磷酸氫二鈉0.18％。發酵培養基：蔗糖10％，蛋白胨0.25％，磷酸氫二鈉0.18％，所述的百分比為質量百分比，pH值優選7.2～7.6，更優選7.4；；

其中，從所述的發酵液中分離高分子右旋糖酐的方法包括向發酵液中加入85％乙醇使發酵液中乙醇的體積濃度為35％～38％，右旋糖酐沉淀后，再經85％乙醇捏洗至“老化”；

(2)高分子右旋糖酐的糊化

高分子右旋糖酐用蒸餾水按照濕糖酐與緩沖溶液按照1∶1.8(w/V)配制成高分子右旋糖酐溶液，在90度條件下保溫12小時。

(3)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐

向步驟3)加入右旋糖酐酶使其終濃度為0.5IU/mL，置于35℃條件下攪拌反應130～150min，然后終止酶催化反應。

其中，所述的右旋糖酐酶的一個酶活U是指，以蒸餾水配制的終體積濃度為3.0％的重均分子量為70kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35度條件下，每分鐘產生1μmol還原糖所需要的右旋糖酐酶量；

(4)去除雜質