[發(fā)明專利]大腸桿菌混合溶組織內(nèi)阿米巴在制備治療肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310245877.2
• 申請日: 2013-06-20
• 公開（公告）號: CN103301163A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐慶;程訓(xùn)佳;何松青;梁榮感;韋京辰;張均智;莫剛;楊成芳
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: A61K35/74
• 分類號: A61K35/74;A61P35/00;A61K35/68
• 代理公司: 桂林市華杰專利商標(biāo)事務(wù)所有限責(zé)任公司 45112
• 代理人: 巢雄輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療肝惡性實(shí)體瘤的生物治療，特別是大腸桿菌混合溶組織內(nèi)阿米巴在制備治療肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

肝癌素有癌中之王的稱號,20世紀(jì)90年代原發(fā)性肝癌已上升為惡性腫瘤的第2位，全球每年約有31萬患者，中國每年有13萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡總數(shù)的42%。?

目前，原發(fā)性肝癌的治療仍采用以手術(shù)為主的綜合治療，包括化療、物理療法（放射、超聲、熱療、低溫技術(shù)）、生物治療、中醫(yī)中藥治療等。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biological?response?modifier，BRM)理論的提出為生物治療開辟了全新的領(lǐng)域。生物治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第四種模式，并顯示出了良好的應(yīng)用前景。目前，生物治療主要包括：免疫治療、基因治療、抗血管生成治療、內(nèi)分泌治療等。但是,上述治療方法仍存在毒副作用大、條件要求高、療效不滿意等問題：如外科切除雖然是目前最有效的治療手段，但其5年生存率經(jīng)過幾十年努力也未能繼續(xù)前進(jìn)一步，仍停滯在7%。肝移植作為一種肝癌根治方法，既不用考慮剩余肝組織的代償能力而完整切除腫瘤，又能避免殘余病肝組織的惡變可能，是目前最徹底、最有效的治療手段，由于移植適應(yīng)證的擴(kuò)大將使大量的肝癌患者納入移植隊(duì)列，勢必對器官資源的分配產(chǎn)生重要影響。由于肝源的缺乏，等待時間的延長導(dǎo)致候選患者退出率達(dá)20％。?

溶組織內(nèi)阿米巴（Entamoeba?histolytica）可寄生人類大腸，滋養(yǎng)體侵犯宿主腸粘膜可以引起阿米巴性結(jié)腸炎和腸外膿腫。溶組織內(nèi)阿米巴最重要的特性是以接觸依賴的方式殺傷宿主細(xì)胞，其中半乳糖/乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素（Gal/GalNAc）具有附著宿主細(xì)胞的作用,與蟲體的吸附和細(xì)胞毒性有關(guān)。阿米巴穿孔素（amoeba?pores）則是一組存在于滋養(yǎng)體胞質(zhì)顆粒中的小分子蛋白。滋養(yǎng)體與靶細(xì)胞接觸或侵入組織時可注入這些微孔形成蛋白，在靶細(xì)胞，例如腸壁細(xì)胞、肝細(xì)胞、免疫細(xì)胞，脂膜中形成離子通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升20倍之多，以致出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞在5分鐘至15分鐘內(nèi)死亡。借助溶組織內(nèi)阿米巴凝集素附著于宿主細(xì)胞，繼而穿孔素使細(xì)胞出現(xiàn)毒性和細(xì)胞溶解作用，而另一主要蛋白半胱氨酸蛋白酶（cysteine?proteinase，CP）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和溶解宿主細(xì)胞，參與溶組織內(nèi)阿米巴侵襲和破壞組織。由于CP的存在，阿米巴顯示很強(qiáng)的蛋白水解酶活性，其屬于木瓜蛋白酶大家族。。實(shí)驗(yàn)證實(shí):溶組織內(nèi)阿米巴不僅能殺傷正常組織細(xì)胞,而且也能吞噬、殺滅腫瘤細(xì)胞。我們以KB細(xì)胞為靶細(xì)胞,采取混合培養(yǎng)方法,在顯微鏡下動態(tài)觀察了不同時?間段溶組織內(nèi)阿米巴對KB細(xì)胞的吞噬殺滅過程,1×10⁴蟲體/ml在18小時內(nèi)可將濃度為1×10⁶/ml?KB細(xì)胞全部殺滅。在我們前期工作中證實(shí)：溶組織內(nèi)阿米巴SAW755CR（強(qiáng)毒株）與Caco-2cell(人結(jié)腸癌細(xì)胞);Hela?cell(人宮頸癌細(xì)胞);HepG-2cell（人肝癌細(xì)胞）共同孵育2小時，腫瘤細(xì)胞可被殺滅約50%。?

在體內(nèi)，滋養(yǎng)體可藉其溶解破壞之能力，隨血流進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，首先至肝臟，因肝小葉微靜脈有過濾作用而停留在微靜脈末端。如果侵入肝臟的原蟲數(shù)量不多，且人體抵抗力強(qiáng)，可將原蟲消滅而不造成損害。若機(jī)體抵抗力下降，或肝臟內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，侵入肝臟的阿米巴滋養(yǎng)體可引起微靜脈及其周圍組織的炎性反應(yīng)，滋養(yǎng)體迅速繁殖，形成微靜脈栓塞，導(dǎo)致該處肝組織缺氧、缺血，滋養(yǎng)體從被破壞的血管內(nèi)逸出，引起肝組織的灶性壞死、液化而成為微小膿腫，相鄰之膿腫互相融合，最后形成臨床上的大膿腫(amoebic?liver?abscess)。發(fā)明內(nèi)容?

本發(fā)明的目的是要提供大腸桿菌配合溶組織內(nèi)阿米巴在制備治療肝癌實(shí)體瘤藥物中的應(yīng)用。具體地說是將大腸桿菌與溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體按比例混合制成治療肝癌惡性實(shí)體瘤的細(xì)胞懸液制劑藥物。?

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：?